Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Material und Methoden
Der Reaktionsmix wurde unter einer DNA-Workstation (L020-GC, DNA/RNA UV-
Cleaner UVC/FM-AR; G. Kisker GbR, D-48543 Steinfurt) mit eigens für diesen Zweck
vorgesehenen und halbjährlich kalibrierten Pipetten in DNAse- und RNAse-freien,
sterilen EC 1.5 hergestellt. Danach wurden 22,5 µl Master-Mix in die Vertiefungen
einer 96 well plate pipettiert, die in einem rack (MicroAmp Splash Free 96-Well
Base, Part No.: 4312063; Applied Biosystems) positioniert war. Nach Zugabe von 2,5
µl template-DNA wurde die 96 well plate mit einer Folie (MicroAmp Optical
Adhesive Film, Lot 2006 11298, Applied Biosystems) unter Verwendung eines
Applikators (Adhesive Seal Applicator, Part No.: 436 5988, Applied Biosystems)
verschlossen. Es folgte eine Zentrifugation (Centrifuge 5810R, 5811 no:0035525;
Eppendorf AG) für eine Minute bei 1000 g um mögliche Luftblasen, die eine optische
Messung in der real-time PCR verfälschen, aus dem Reaktionsmix zu entfernen.
Alle Materialien (Plastikware, Reagenzien, etc.), die in der real-time PCR verwendet
wurden, waren für die PCR lizenziert und als DNA/RNA- resp. DNase/RNase-frei
zertifiziert. Reagenzien mit Volumina ≤10 µl wurden mit speziellen Filterspitzen (ep
Dualfilter T.I.P.S. 0,1 – 10 µl S, Eppendorf AG) pipettiert. Hautkontakt mit der
Plastikware (Plate, Folie, etc.) wurde durch das Tragen von Einmalhandschuhen
(Nobaglove ® - Latex, NOBA Verbandmittel Danz GmbH und Co KG, D-58300 Wetter)
unterbunden, da auch Spuren von Feuchtigkeit und Fetten der Haut mit der
optischen Messung in der real-time PCR interferieren.
Um mögliche Inhibitionen der Amplifikation von Zielsequenzen erkennen zu können,
wurde in den Reaktionsmix eine interne Amplifikationskontrolle integriert (s. Kap.
3.2.14). Mit Verwendung dieser internen Positivkontrolle (IPC) (TaqMan ® Exogenous
Internal Positive Controll Reagents (VIC Probe), Part No. 4308323, Applied
Biosystems) wurde die Zusammensetzung der Reaktionsmix für alle folgenden
Versuche wie folgt verändert:
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