Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

3.2.19 Robustheit
Material und Methoden
Die Robustheit gibt die Sicherheit des Testes bei bewussten Veränderungen der
Versuchsbedingungen an. Das Maß dieser Veränderungen ist nicht festgelegt. Zur
Prüfung der Robustheit des Testsystems wurden wiederholte Untersuchungen an 10
DNA-Extrakten (siehe Kapitel 3.2.16) durchgeführt. In jeder Untersuchung wurden
die Versuchsbedingungen verändert:
R1: der fertige Reaktionsmix wurde für 12 Stunden lichtgeschützt bei
Raumtemperatur inkubiert.
R2: der fertige Reaktionsmix wurde innerhalb von 12 Stunden lichtgeschützt 10
Mal eingefroren und wieder aufgetaut
R3: der fertige Reaktionsmix wurde für 5 Minuten unter der DNA-Workstation mit
UV-Licht bestrahlt.
R4: die template-DNA wurde mit Pipettenspitzen der Größe L (ep Dualfilter T.I.P.S.
0,1 – 10 µl L; Eppendorf AG) anstatt mit Spitzen der Größe S zum
Reaktionsmix in die Vertiefungen der 96 well plate pipettiert
R5: in die 96 well plate wurde Reaktionsmix und template-DNA pipettiert. Die
Platte wurde mit einer Folie verschlossen und anschließend einer so starken
Erschütterung ausgesetzt, dass die Unterseite der Folie sichtbar mit
Flüssigkeit bedeckt war.
R6: der fertige Reaktionsmix, in dem die template-DNA bereits enthalten war,
wurde für fünf Stunden ohne Lichtschutz bei Raumtemperatur inkubiert.
Der Reaktionsmix für den Standard wurde ohne jede Änderung der sonst üblichen
Versuchsbedingungen hergestellt und erst unmittelbar vor der PCR in die 96 well
plate pipettiert. Alle Platten wurden vor dem Einlegen in das real-time Gerät für eine
Minute bei 1000 g zentrifugiert (Centrifuge 5810R). Die real-time PCR wurde ohne
Modifikationen durchgeführt (Tab. 35).
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