Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Material und Methoden
Die Auswertung erfolgte entweder durch Betrachtung und Analyse der
Amplifikationskurven (real-time PCR) oder durch eine Gelelektrophorese.
Amplifikationskurven stellen das normierte und baseline-korrigierte
Fluoreszenzsignal in jedem well für jeden Amplifikationszyklus graphisch aufgetragen
gegen die Anzahl der Zyklen dar. Die Stärke des Fluoreszenzsignals ist proportional
zur Menge des PCR-Produkts.
Eine Probe wurde als positiv bewertet, wenn
a) die Amplifikationskurve für die Sonde (FAM) einen Schnittpunkt mit dem
und
threshold aufwies
b) die Fluoreszenzkurve für die passive Referenz (ROX) keinen signifikanten
Anstieg erkennen lies; dieses wäre als ein Hinweis auf Verdunstung
interpretiert worden.
Eine Probe wurde als negativ bewertet, wenn
a) die Amplifikationskurve (FAM) keinen Schnittpunkt mit dem treshold aufwies
und
b) die Amplifikationskurve für die IPC (VIC), sofern verwendet, einen
Schnittpunkt mit dem threshold aufwies.
Für die quantitative Auswertung wurde jede Probe und der Standard im
Dreifachansatz untersucht. In der absoluten Quantifizierung (standard curve) waren
die vom real-time System berechneten Ct-Werte die Grundlage der Auswertung von
Ergebnissen. Die Höhe der baseline wurde von der Software anhand der
Hintergrundfluoreszenz in den Zyklen drei bis 15 berechnet und der threshold
manuell auf 0,1 festgelegt. In der relativen Quantifizierung (ddCt Plate) wurden die
Ergebnisse der Proben in Relation zu einem Standard „S3“ betrachtet. Die Höhe der
baseline wurde auch hier durch das System berechnet und der threshold manuell auf
0,1 festgelegt. Ausreißer, die zu einer erhöhten Standardabweichung in den drei Ct-
Werten einer Probe führten, wurden von der Software nicht in die Berechnungen
einbezogen.
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