Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

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Material und Methoden 3.3 Prüfung der Homogenisierung von Kotproben zum Nachweis von L. intracellularis In festem und halbfestem Probenmatrial wie bspw. Kot kann nicht grundsätzlich von der homogenen Verteilung eines Erregers in der Probenmatrix ausgegangen werden. Eine inhomogene Verteilung kann jedoch dazu führen, dass bei mehrfacher Untersuchung derselben Probe unterschiedliche Ergebnisse erzielt werden. Mit dem Ziel, die Verteilung von L. intracellularis in Kotproben zu überprüfen, wurden verschiedene Verfahren der Homogenisierung angewendet. Die Untersuchung wurde an Kot aus dem Enddarm eines Schweins durchgeführt. Die Kotprobe wurde zunächst mittels real-time PCR auf den Gehalt von L. intracellularis untersucht. Die als L. intracellularis negative beurteilte Probe wurde auf sechs Aliquots zu je 2 Gramm Kot aufgeteilt. Drei Aliquots wurden mit 100 µl einer Plasmidlösung (2,89 x 10 7 GE, 2,89 x 10 5 GE resp. 5,78 x 10 3 GE pro µl) gemischt. Die Proben wurden anschließend eine Minute mit dem Kotlöffel einer Stuhlröhre homogenisiert. Die übrigen drei Aliquots wurden ebenfalls mit je 100 µl einer Plasmidlösung (2,89 x 10 7 GE, 2,89 x 10 5 GE resp. 5,78 x 10 3 GE pro µl) gemischt, jedoch wurde zur Verringerung der Viskosität des Probenmaterials zusätzlich 900 µl Lichrosolv ® zu jeder Probe pipettiert. Auch diese Aliquots wurden mit dem Kotlöffel einer Stuhlröhre eine Minute homogenisiert. Aus den sechs Aliquots wurden jeweils dreimal 200 mg in EC 2.0 eingewogen. Die DNA aus den Proben wurde mit dem QIAamp ® DNA Stool Mini Kit isoliert und spezifische Genomfragmente anschließend in der real-time PCR quantifiziert (Tab. 36). 89
Material und Methoden Tabelle 36: Protokoll der PCR zur Überprüfung der Homogenisierung DNA-template: präparierte Proben nicht infizierter Schweine Aufgereinigt mit: QIAamp ® DNA Stool Mini Kit Reaktionsmix: 12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix 2x 9 µl Primer- Mix 0,8 µl Exo IPC Mix 10x 0,2 µl Exo IPC DNA 50x 2,5 µl template-DNA PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System PCR-Protokoll: s. Tabelle 7 Modifikationen: keine Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für FAM 90
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Quantitativer Nachweis von Lawsonia
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Wissenschaftliche Betreuung: Priv.-
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Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung....
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3.2.18 Wiederfindungsrate .........
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µg Mikrogramm (x 10 -6 ) µl Mikro
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p.i. post infectionem PCR polymeras
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2 Literaturübersicht Literaturübe
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2.2 Lawsonia intracellularis Litera
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Literaturübersicht Desinfektionsmi
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Literaturübersicht Altersgruppe de
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Subklinischer Verlauf: Literaturüb
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Literaturübersicht Lagerung bei -8
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Nichtspezifische Detektionssysteme
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Seite 85 und 86: 3.2.11 Klonierung Material und Meth
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Summary genome equivalent per react
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ANONYM (1998b): Literaturverzeichni
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Literaturverzeichnis BOESEN, H.T.,
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Literaturverzeichnis CORZO, C.A., R
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Literaturverzeichnis GROSS-BELLARD,
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Literaturverzeichnis HOLLAND, P.M.,
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Literaturverzeichnis JORDAN, D.M.,
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Literaturverzeichnis LINDECRONA, R.
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Literaturverzeichnis NIEDERHAUSER,
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SAIF, L.J., u. R.D. WESLEY (1999):
Seite 179 und 180:
Literaturverzeichnis SUH, D.-K., S.
Seite 181 und 182:
Literaturverzeichnis WIDJOJOATMODJO
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Anhang 7 12.12 12.1066667 7 12.11 6
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Anhang Tabelle 47: Quantität von G
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Anhang Tabelle 51: Ergebnisse der q
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Danksagung Ich danke Frau Priv.- Do
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