Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Absolute Quantifizierung
Literaturübersicht
In der absoluten Quantifizierung werden externe Standards, wie bspw. in vitro-
Transkripte, rekombinante Nukleinsäuren oder DNA, verwendet, mit denen eine
Standardkurve erstellt wird. Die Ct-Werte der Standards, untersucht in einer
Verdünnungsreihe, werden gegen die bekannten, logarithmierten Werte der
Ausgangsmenge aufgetragen. Das Intervall, das von der Standard-
Verdünnungsreihe inkludiert wird, sollte den Arbeitsbereich einschließen. Die Ct-
Werte der Standardkurve sollten durch Mehrfachbestimmungen validiert werden
(BUSTIN 2000, FRONHOFFS et al. 2002, FERRE 1992); in der Literatur wird dazu
die Untersuchung im dreifachen Ansatz für jede Verdünnungsstufe empfohlen
(LARIONOV et al. 2005). An einer Standardkurve kann durch Vergleich der Ct-Werte
unbekannter Proben deren Ausgangsmenge von Ziel-DNA abgeleitet werden.
Darüber hinaus kann mit Hilfe der Standardkurve die Effizienz der Amplifikation
berechnet werden (BUSTIN 2000, FRONHOFFS et al. 2002). Die Effizienz der
Amplifikation von Standard und Zielsequenz sollte vergleichbar sein. Sind Standard
und Zielsequenz identisch, so können beide mit demselben Master-Mix amplifiziert
werden (FRONHOFFS et al. 2002). In jeder PCR sollte die Standardkurve trotz ihrer
guten Reproduzierbarkeit neu bestimmt werden (LARIONOV et al. 2005).
Relative Quantifizierung
Die relative Quantifizierung erlaubt eine Aussage über die Menge einer Ziel-DNA im
Verhältnis zu einer Referenz, ermöglicht aber nicht, die Ausgangsmenge der Ziel-
DNA absolut zu bestimmen. Diese Art der Quantifizierung wird überlicherweise in
Genexpressionsstudien verwendet, um die Expression des Zielgens mit der
Expression eines Referenzgens zu vergleichen (PFAFFL 2004a). Die Expression des
Referenzgens wird nicht reguliert und ist konstant (PFAFFL 2004b). Housekeeping
genes, wie Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) oder β-Aktin, sind
als Referenzgene (internes Kontrollgen, endogene Referenz) geeignet (LIVAK u.
SCHMITTGEN 2001). Mithilfe der ∆∆Ct-Methode wird der Ct-Wert des Zielgens
gegen den Ct-Wert der endogenen Referenz normalisiert (∆Ct). Diese Berechnung
wird sowohl bei einer unbehandelten wie auch bei einer behandelten Probe
durchgeführt, so dass beide erhaltenen ∆Ct-Werte voneinander abgezogen werden
können. Aus diesem ∆∆Ct-Wert kann das Expressionsverhältnis des Zielgens von
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