Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Material und Methoden
(ReddyRun Superladder – Low 100 bp, ABgene) wurde in die äußeren Geltaschen
pipettiert. Die PCR Produkte wurden bei einer Spannung von 1 Volt pro Zentimeter
Länge des Agarosegels (Elektrophoresegerät Biometra Power Pack P25; Biometra
GmbH, D-37079 Göttingen) über einen Zeitraum von 60 Minuten elektrophoretisch
getrennt. Anschließend wurde das Gel 30 Minuten lang in einer 0,1 mM
Ethidiumbromidlösung (Ethidiumbromid 1 %, Merck KGaA) gefärbt und abschließend
in einem Transilluminator analysiert (Alpha Imager 1220 Multimage Light cabinet
plus, Seikosha VP 1500; Biozym Scientific GmbH, D-31833 Hess. Oldendorf).
Die Ergebnisse der zweiten und dritten Wiederholung wurden mittels Sequence
Detection Software Version 1.4 analysiert. Den Proben wurde bereits vor der
Reaktion ein interkalierender Farbstoff zugesetzt (Tab. 10, 11 und 12), sodass die
Amplifikation real-time festgestellt werden konnte.
Tabelle 10: Protokoll der PCR (I) zur Optimierung der Primer-Konzentration
DNA-template: Lawsonia intracellularis MS B3903
Aufgereinigt mit: DNeasy ® Blood & Tissue Kit
Reaktionsmix:
12,5 µl ReadyMix Taq PCR Reaction Mix 2x
x µl Primer Li-Ubi F
x µl Primer Li-Ubi-R
Wasser ad 22,5 µl Reaktionsvolumen
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: first denaturation: 300 statt 600 Sekunden
Ergebnisauswertung: Gelelektrophorese
(3 %ige Midi-Agarosegel, Laufzeit: 1 h)
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