Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

3.2.11 Klonierung
Material und Methoden
Mit dem Ziel, einen Standard für die absolute Quantifizierung herzustellen, wurde ein
Abschnitt des Zielgens, in dem auch die Zielsequenz der real-time PCR kodiert ist, in
einen Vektor ligiert. Mit diesem Vektor wurden kompetente E. coli transformiert und
anschließend in Kulturmedium vermehrt. Die Plasmide mit der Zielsequenz wurden
isoliert und als Standards verwendet. Plasmid-DNA eignet sich für diese Applikation
besonders gut, weil sie eine hohe Stabilität besitzt und reproduzierbare Ergebnisse
erzeugt.
Die DNA des Referenzstammes Lawsonia intracellularis MS B3930 und drei L.
intracellularis-positiver Kotproben aus der Routinediagnostik wurden aufgereinigt
(DNeasy ® Blood & Tissue Kit und QIAamp ® DNA Stool Mini Kit) und spezifische
Genomfragmente von L. intracellularis mit den Primern Ubi-Clon-lang-F und –R
amplifiziert. Diese Primer kopieren einen größeren Genomabschnitt von L.
intracellularis, der die eigentliche Zielsequenz der real-time PCR beinhaltet. Zur
Überprüfung der optimalen annealing-Temperatur der Primer Ubi-Clon-lang-F und –
R wurde zunächst eine Gradienten-PCR auf dem Thermocycler durchgeführt (Tab.
21). Anschließend wurde die DNA aller vier Proben mit einem Protokoll amplifziert,
dass eine annealing-Temperatur von 61,6 °C enthielt (Tab. 22).
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