Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

3.2.17 Wiederholpräzision
Material und Methoden
Die Wiederholpräzision wurde aus den Ergebnissen zur Ermittlung der
Standardkurve abgeleitet. Darüber hinaus wurden 10 DNA-Extrakte (siehe Kapitel
3.2.16) mittels real-time PCR in drei voneinander unabhängigen Versuchen
wiederholt quantifiziert (Tab. 31).
Tabelle 31: Protokoll der PCR zur Feststellung der Wiederholpräzision
DNA-template:
Proben natürlich infizierter und nicht infizierter
Schweine
Aufgereinigt mit: QIAamp ® DNA Stool Mini Kit
Reaktionsmix:
12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix 2x
9 µl Primer- Mix
0,8 µl Exo IPC Mix 10x
0,2 µl Exo IPC DNA 50x
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: keine
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für FAM
3.2.18 Wiederfindungsrate
Die Wiederfindung ist ein Maß für die Ausbeute der gesamten Methode. Dieses Maß
bezieht sich auf die gesamte Methode, die sowohl die Probenaufbereitung als auch
die DNA-Amplifikation selbst beinhaltet. Zur Bestimmung der Wiederfindungsrate ist
von 10 Schweinen, die zur Sektion an die Außenstelle für Epidemiologie eingesendet
wurden, eine Kotprobe aus dem Enddarm entnommen worden. Die DNA aus den
Kotproben wurde isoliert (QIAamp ® DNA Stool Mini Kit) und mittels real-time PCR auf
den Gehalt von GE von L. intracellularis untersucht (Tab. 32). Sieben der 10 Proben
wiesen keinen Gehalt spezifischer Genomfragment von L. intracellularis auf - waren
also negativ - und eigneten sich daher für die weitere Untersuchung.
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