Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Material und Methoden
3.3 Prüfung der Homogenisierung von Kotproben zum Nachweis
von L. intracellularis
In festem und halbfestem Probenmatrial wie bspw. Kot kann nicht grundsätzlich von
der homogenen Verteilung eines Erregers in der Probenmatrix ausgegangen werden.
Eine inhomogene Verteilung kann jedoch dazu führen, dass bei mehrfacher
Untersuchung derselben Probe unterschiedliche Ergebnisse erzielt werden. Mit dem
Ziel, die Verteilung von L. intracellularis in Kotproben zu überprüfen, wurden
verschiedene Verfahren der Homogenisierung angewendet.
Die Untersuchung wurde an Kot aus dem Enddarm eines Schweins durchgeführt.
Die Kotprobe wurde zunächst mittels real-time PCR auf den Gehalt von L.
intracellularis untersucht. Die als L. intracellularis negative beurteilte Probe wurde auf
sechs Aliquots zu je 2 Gramm Kot aufgeteilt. Drei Aliquots wurden mit 100 µl einer
Plasmidlösung (2,89 x 10 7 GE, 2,89 x 10 5 GE resp. 5,78 x 10 3 GE pro µl) gemischt.
Die Proben wurden anschließend eine Minute mit dem Kotlöffel einer Stuhlröhre
homogenisiert. Die übrigen drei Aliquots wurden ebenfalls mit je 100 µl einer
Plasmidlösung (2,89 x 10 7 GE, 2,89 x 10 5 GE resp. 5,78 x 10 3 GE pro µl) gemischt,
jedoch wurde zur Verringerung der Viskosität des Probenmaterials zusätzlich 900 µl
Lichrosolv ® zu jeder Probe pipettiert. Auch diese Aliquots wurden mit dem Kotlöffel
einer Stuhlröhre eine Minute homogenisiert.
Aus den sechs Aliquots wurden jeweils dreimal 200 mg in EC 2.0 eingewogen. Die
DNA aus den Proben wurde mit dem QIAamp ® DNA Stool Mini Kit isoliert und
spezifische Genomfragmente anschließend in der real-time PCR quantifiziert (Tab.
36).
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