Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Ergebnisse
Mit einer Konzentration von 10 -2 GE / µl konnten in dieser Versuchsreihe keine
reproduzierbaren Daten ermittelt werden. Die Konzentration von 1x10 -3 GE / µl
Reaktionseinheit ergab einmalig einen Ct-Wert von 40,4. Dieser Wert wurde in der
Standardkurve (Abb. 7) nicht aufgetragen. Die Steigung der Standardkurve resp. -
gerade beträgt –3,329. Die Effizienz der real-time PCR ist somit 99,7 %. Die
Linearität ist zwischen den Konzentrationsstufen 10 7 und 10 0 GE / µl
Reaktionseinheit gegeben, so dass dieser Bereich als Kalibrierbereich festgelegt
werden konnte. Die untere Nachweisgrenze der real-time PCR beträgt 1 GE im
Reaktionsvolumen. Die obere Nachweisgrenze beträgt bei 10 8 GE / µl
Reaktionsvolumen. Konzentrationen von 10 9 GE / µl oder mehr konnte vom real-time
Gerät aufgrund der hohen Ausgangsmenge von template-DNA nicht mehr dargestellt
werden.
Eine absolute Quantifizierung ist im Bereich von 10 1 bis 10 7 GE / µl
Reaktionsvolumen möglich. Oberhalb von 10 7 GE / µl Reaktionsvolumen steigen die
Ct-Werte nicht mehr linear zur eingesetzten Menge der DNA an (Abb. 8). Ist die
Konzentration der template-DNA etwas geringer als 10 1 GE / µl Reaktionsvolumen,
besteht zwar ein signifikanter Unterschied zum Ct-Wert von 10 0 GE / µl
Reaktionsvolumen (p =0.0006), allerdings fehlt ein signifikanter Unterschied
zwischen 10 0 und 10 -1 GE / µl Reaktionsvolumen (p =0,11).
In einem ml Eluat aus der DNA-Isolierung beträgt die untere Nachweisgrenze
rechnerisch 4x 10 2 GE L. intracellularis, die obere Nachweisgrenze beträgt 1x 10 12
GE. Absolut quantifizierbar sind demnach Plasmidlösungen, die eine Konzentration
spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis zwischen 1x 10 5 und 1x 10 11 pro
ml besitzen.
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