Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Literaturübersicht
der behandelten zur nicht behandelten Probe berechnet werden. Eine grundlegende
Voraussetzung für diese Berechnung ist, dass Zielgen und Referenzgen in der PCR
mit gleicher Effizienz amplifiziert werden (LIVAK u. SCHMITTGEN 2001, PFAFFL
2004b). Sind die Effizienzen unterschiedlich, kann das zu Fehlern in der Berechnung
führen. Fehler dieser Art lassen sich ausschließen, indem eine effizienz-korrigierte
Quantifizierung durchgeführt wird (PFAFFL 2004b, PFAFFL 2001). Diese Methode
basiert auf dem Vergleich der Ct-Werte einer Probe und der bekannten Kontrolle
(Ct Kontrolle – Ct Probe = ∆Ct). Die Expression wird dabei unter Berücksichtigung der
PCR-Effizienzen relativ zum Referenzgen (Ct-Ref Kontrolle – Ct-Ref Probe = ∆Ct-Ref)
ausgedrückt. Wird das Referenzgen stabil exprimiert, kann die Normalisierung zu
diesem entfallen. Die Berechnung der Expression beruht dann allein auf dem ∆Ct
von Probe und Kontrolle und der Effizienz der Amplifikation der Ziel-DNA. Folgende
Formel wurde angewendet:
Rate der Expression = (E target) ∆Ct
mit E= Effizienz der Amplifikation = 10
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(-1/Steigung der Standardkurve)
Auf diese Weise kann auf die Erstellung einer Standardkurve in jedem Ansatz
verzichtet werden (PFAFFL 2001) und die relative Quantifizierung unter Verwendung
der Referenz für eine absolute Quantifizierung genutzt werden.