Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Material und Methoden
Tabelle 18: Reaktionsmix der real-time PCR inklusive IPC
Reaktionsmix:
Gesamtvolumen:
12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix 2x
9 µl Primer- Mix
0,8 µl Exo IPC Mix 10x
0,2 µl Exo IPC DNA 50x
2,5 µl template-DNA
25 µl
In jeder PCR wurde auch eine negative template control (NTC) untersucht. Die NTC
beinhaltete den Reaktionsmix und 2,5 µl Wasser anstatt einer template-DNA. In der
Positivkontrolle wurde zunächst template-DNA des Referenzstamms (Lawsonia
intracellularis MS B3903) verwendet. Später wurde diese Art einer
„einfachen“ Positivkontrolle, die nur eine korrekte Amplifikation erkennen lässt, durch
eine positive Extraktionskontrolle ersetzt. Sie wurde aus Kot von Schweinen
hergestellt, in dem spezifische Genomfragmente von L. intracellularis mittels PCR
nicht nachweisbar waren. Diesen Proben wurde dann eine geringe Menge
plasmidaler DNA zugesetzt, die erstens die Zielsequenz der real-time PCR beinhaltet
und zweitens nur gerade über dem unteren Detektionslimit ein positives Signal
erzeugt. Die negative Extraktionskontrolle bestand aus Kot von Schweinen, in dem
wiederholt keine spezifischen Genomfragmente von L. intracellularis nachgewiesen
werden konnten. Diese Kontrollen wurden in EC 2.0 aliquotiert und bis zur
Bearbeitung resp. Untersuchung im Gefrierraum bei -20 °C gelagert. In jedem
Versuch wurde die positive Kontrolle im Anschluss an die eigentlichen Proben und
die negative Kontrolle an letzter Stelle behandelt resp. untersucht.
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