Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Literaturübersicht
an diese, wodurch ein längerer und stabilerer Doppelstrang entsteht als in der
Haarnadelstruktur. Durch die nun lineare Struktur entfernen sich Donor und Akzeptor
und es wird ein Fluoreszenzsignal messbar. Diese Art der Sonde zeichnet sich durch
eine hohe Spezifität während der Hybridisierung aus, da schon eine einzige
unpassende Base genügt, um eine Hybridisierung zu verhindern (TYAGI u. KRAMER
1996).
Displacement probe
Diese Sonde besteht aus zwei komplementären Oligonukleotidsträngen. Der Strang,
der an die Zielsequenz binden soll, ist länger als der andere. Am 5´-Ende des langen
Stranges befindet sich der Donor. Am 3´-Ende des Komplementärstranges ist der
Akzeptor gebunden. Liegt die Sonde als ds-DNA vor, sind in diesem Doppelstrang
Donor und Akzpetor in räumlicher Nähe. Durch die Zielsequenz wird der
Komplementärstrang von dem eigentlichen Hybridisierungsstrang verdrängt
(displacement hybridisation) und es entsteht Fluoreszenz. Die überragende Spezifität
und die hohe Sensitivität werden als Vorteil dieser Technik bewertet (LI et al. 2002).
Light-Up probe
Eine light-up probe ist ein Oligonukleotid aus peptide nucleic acid (PNA). An diesem
Oligonukleotid ist über einen linker der Cyaninfarbstoff Thiazolorange gebunden. Die
Fluoreszenz des Farbstoffes steigt mit der Hybridisierung der Sonde an die
Zielstruktur bis auf das 50fache der Grundfluoreszenz an. Die relativ hohe
Fluoreszenz der freien Sonde beruht auf den Interaktionen des Farbstoffes mit den
Basen der Sonde selbst. Dieses unerwünschte Phänomen wurde durch den Einsatz
der PNA als Grundgerüst minimiert (SVANVIK et al. 2000).
Minor groove binder
Mit dem Ziel, die Hybridisierungseigenschaften von Sonden zu verbessern, können
minor groove binder (MGB) an das Ende von Sonden gebunden werden. Diese
Moleküle stabilisieren die Sonden-DNA-Doppelhelix durch ihr „Einklappen“ in die
kleine Furche der Doppelhelix. Die Schmelztemperatur der so stabilisierten
Doppelhelix ist signifikant höher. In der Folge können kürzere Sonden eingesetzt
werden, die in der Regel eine höhere Spezifität besitzen (KUTYAVIN et al. 2000).
39