Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Diskussion
Verbindung mit dem spezifischen PCR-Produkt ein Fluoreszenzsignal. Einfach
interaklierende Farbstoffe stellen im Gegensatz dazu jede ds-DNA der Reaktion dar
(BUSTIN u. NOLAN 2004). Zusammenfassend kann davon ausgegangen werden,
das real-time PCRs mit Sondentechnologie eine höhere analytische Spezifität
besitzen als real-time PCRs, bei denen interkalierende Farbstoffen verwendet
werden.
5.1.2 Analytische Spezifität von Primer und Sonde
Die Spezifität ist die Fähigkeit eines Testsystems, den Analyten auch dann eindeutig
in einer Probe zu identifizieren, wenn andere Komponenten in der Probenmatrix
enthalten sind (ANON. 1998b). Primer und die Sonde sind die Bestandteile der PCR,
die Einfluss auf die analytische Spezifität nehmen (BANGSOW et al. 2007). Neben
der theoretisch berechneten, spezifischen Bindung der Primer an Genomfragmente
von L. intracellularis wurde die Spezifität der Primer Li-Ubi-F und –R im SYBR
Green-System überprüft. An den Ergebnissen einer Schmelzkurvenanalyse konnte
gezeigt werden, dass die Primer bei einer Amplifikation der DNA von L. intracellularis
MS B3903 nur ein einziges PCR-Produkt bilden. Da beim Schwein zahlreiche
Bakterien regelmäßig vorkommen, wurde eine mögliche Amplifikation von deren
DNA geprüft. Nur bei wenigen Erregern konnte nach einer hohen Anzahl von Zyklen
ein Fluoreszenzsignal detektiert werden. Da diese unerwünschte Amplifikation in den
Wiederholungen des Versuches bei unterschiedlichen Erregern auftraten, ist davon
auszugehen, dass die Primer nicht an eine spezifische Genomsequenz der
jeweiligen Erreger hybridisiert haben, sondern eine unspezifische Amplifikation zu
den Signalen geführt hat. Die Möglichkeit eines hoch spezifischen Nachweises von L.
intracellularis mittels PCR wurde auch in anderen Studien anhand des Ausbleibens
einer Amplifikation der DNA anderer Bakterienstämme für die jeweiligen Primern
bestätigt (LA et al. 2006, LINDECRONA et al. 2002, NATHUES 2007).
Die Sequenz der PCR-Produkte aus Untersuchungen an Kotproben natürlich
infizierter Schweine zeigte in allen Untersuchungen eine 100 %ige Übereinstimmung
mit der Genomsequenz des Typstamms von L. intracellularis (accession number
AM180252, GenBank). Die hohe Übereinstimmung lässt den Schluss zu, dass in
diesem Ausgangsmaterial ausschließlich spezifische PCR-Produkte in großer Menge
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