Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Material und Methoden
dem Vortex geschüttelt, bis sich die Tablette vollständig aufgelöst hatte. Danach
wurde die Suspension für sechs Minuten bei 20000 g zentrifugiert, der Überstand in
ein Eppendorf Cup 1.5 (Safe-Lock Tubes 1,5 ml, Eppendorf AG) (EC 1.5) dekantiert
und wiederum für sechs Minuten bei 20000 g zentrifugiert. Maximal 200 µl des
Überstandes wurde in ein EC 1.5 pipettiert, in dem bereits 15 µl Proteinase K
vorgelegt worden waren. Es wurden 200 µl AL-Puffer zugegeben und die Probe
unmittelbar für 15 Sekunden auf dem Vortex geschüttelt. Es folgte eine Inkubation für
10 Minuten bei 70 °C. Nach einer kurzen Zentrifugat ion wurden dem Lysat 200 µl
Ethanol (96 %ig) zur DNA-Fällung zugegeben, die Probe sofort geschüttelt und kurz
zentrifugiert. Der gesamte Inhalt aus dem Reaktionsgefäß wurde auf die Säule
dekantiert, die zuvor in ein Sammelröhrchen gesetzt worden war. Die Säule wurde
für eine Minute bei 20000 g zentrifugiert und in ein neues Sammelröhrchen
umgesetzt. Es wurden 500 µl AW1-Puffer zugegeben und die Säule wurde erneut für
eine Minute für 20000 g zentrifugiert. Die Säule wurde wiederum in ein neues
Sammelröhrchen gesetzt, es wurden 500 µl AW2-Puffer hinzugegeben und für drei
Minuten bei 20000 g zentrifugiert. Diesen beiden Waschschritten folgte ein Schritt
der Trockenzentrifugation für eine Minute bei 20000 g. Nach jeder Zentrifugation
wurde am Boden der Säule überprüft, ob sie mit der Flüssigkeit des
Sammelröhrchens in Kontakt gekommen war. Im Fall, dass Flüssigkeit in oder an der
Säule vorhanden war, wurde der jeweilige Zentrifugationsschritt wiederholt. Zur
Elution der DNA wurde die Säule in ein EC 1.5 gestellt und es wurden 200 µl AE-
Puffer, der zuvor auf 70 °C vorgewärmt wurde, auf d ie Membran pipettiert. Nach
einer Inkubation von einer Minute bei Raumtemperatur wurde die Säule für eine
Minute bei 20000 g zentrifugiert und so die DNA aus der Säule eluiert. Zur
Vermeidung von Kontamination und zum Schutz der DNA wurde die gesamte DNA-
Isolierung an einer Lamina flow Werkbank (Euroflow, EF/4EC/pjo6-001120/03104,
Clean Air Techniek bv, 3449JA Woerden) vorgenommen. Die DNA-Extrakte wurden
im Tiefkühlgefrierschrank bei -70 °C gelagert.
Die Bestimmung der diagnostischen Sensitivität und Spezifität erfolgte durch eine
vergleichende Untersuchung an 300 DNA-Extrakten aus der Routinediagnostik des
Labors der Außenstelle für Epidemiologie in Bakum. Die DNA dieser Proben wurde
ebenfalls unter Verwendung des QIAamp ® DNA Stool Mini Kit nach einer
Methodenanweisung des laborinternen Handbuchs für Qualitätmanagement isoliert.
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