Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Literaturübersicht
sollte allen Schritten der Probenberarbeitung unterzogen und abschließend
amplifiziert werden.
Mit dem Ziel PCR-Inhibitoren nachzuweisen wird dem Reaktionsmix eine interne
Amplifikationskontrolle (IAC) oder interne Positivkontrolle (IPC) zugefügt, die folglich
in jeder Reaktionseinheit eines PCR-Ansatzes vorhanden ist (MALORNY et al. 2003).
Eine IAC ist ein DNA-Abschnitt, der ungleich der Ziel-DNA ist. Eine IAC kann
grundsätzlich mit demselben Primer-Paar amplifiziert werden wie die Ziel-DNA.
Allerdings kommt es bei diesem Verfahren zur Konkurrenzreaktion, wodurch die
Effizienz der PCR beeinflusst werden kann. Eine nicht-kompetetive IAC wird mit
eigenen Primern amplifiziert und ist somit eine eigenständige zweite PCR. Es sollte
darauf geachtet werden, dass die Konzentration der IAC bzw. der entsprechenden
Primer möglichst niedrig ist, um potentielle Konkurrenzreaktionen zu minimieren.
Eine IAC muss in dem Falle, dass kein spezifisches PCR-Produkt entstanden ist,
immer positiv sein (HOORFAR et al. 2004); andernfalls muss von einer Inhibition
ausgegangen werden.
In der Literatur sind verschiedene Möglichkeiten beschrieben, eine IPC zu designen.
In der real-time PCR ist es möglich, der Probe einzelsträngige Oligonukleotide
(internal control oligonucleotide (ICO)) zuzugeben. Diese ICO sind der Zielsequenz
ähnlich, jedoch bindet die entsprechende Sonde nicht. Der Nachweis der ICO-
Amplifikation erfolgt durch eine Schmelzkurvenanalyse (BURGGRAF u.
OLGEMÖLLER 2004). Für L. intracellularis wurde ein mimic entwickelt, das mit den
Primern der Zielsequenz amplifiziert wird. Mimic und spezifisches Amplikon werden
in der Gelelektrophorese anhand ihrer Größe differenziert (JACOBSON et al. 2003b).
2.7.3 Quantifizierung
Die während einer real-time PCR gemessene Fluoreszenz steigt über einen weiten
Bereich linear zur Menge des PCR-Produkts und erlaubt so neben der qualitativen
Aussage (positiv/negativ) auch eine quantitative Aussage über die Menge von
template in der Probe (BUSTIN 2005). Der Ct-Wert dient dabei als Ausgangspunkt
für eine Berechnung zur Feststellung der ursprünglichen Menge von Ziel-DNA resp.
der Anzahl von Genomäquivalenten in der ursprünglichen Probe (HEID et al. 1996).
Die Zahl der Genomäquivalente im PCR-Ansatz kann absolut oder relativ
quantifiziert werden (MACKAY et al. 2002).
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