Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Material und Methoden
3.2.8 Überprüfung der analytischen Spezifität der Sonde
Die Sonde Li-Ubi-Probe soll spezifisch an das PCR-Produkt resp. die Zielsequenz
von L. intracellularis binden und dadurch ein spezifisches Signal erzeugen. Es soll
ausgeschlossen werden, dass die Sonde auch an DNA anderer Erreger in
Probenmaterial vom Schwein hybridisiert. Die Spezifität wurde an DNA der
Referenzstämme und von Lawsonia intracellularis MS B3903 in drei Wiederholungen
mittels real-time PCR getestet (Tab. 16).
Tabelle 16: Protokoll der PCR zur Überprüfung Spezifität der Sonde
DNA-template: Lawsonia intracellularis MS B3903
Referenzstämme
Aufgereinigt mit: DNeasy ® Blood & Tissue Kit
Reaktionsmix:
NucleoSpin ® Tissue Kit
12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix 2x
2,5 µl Primer Li-Ubi F (5 pmol/ µl)
2,5 µl Primer Li-Ubi-R (5 pmol/ µl)
2,5 µl Wasser
2,5 µl Li-Ubi-Probe (2 pmol/ µl)
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: Zyklen: 40 statt 45
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für FAM
66