Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Material und Methoden
Temperaturgradienten in einem oder mehreren Schritten der Reaktion gearbeitet
werden kann. Die minimale Spreizung von einem zum nächsten well beträgt 0,1 °C
bei einer Temperaturspanne von 30 °C bis 99 °C. Vor Beginn der Untersuchung
wurde eine Validierung des Systems durchgeführt. Dazu wurde die Richtigkeit der
Temperatur des Thermoblocks durch Temperaturmessungen an einem externen
Messgerät überprüft (Validierungssystem für MC/ MC ep, Eppendorf AG).
Beide PCR-Systeme standen in einem separaten Raum, in dem ausschließlich PCR
und Gelelektrophoresen durchgeführt wurden.
Im Amplifikationsprotokoll wurden die Phasen des annealing und der extension zu
einem step mit einer Temperatur von 60 °C zusammengefasst, da im TaqMan-
System die Sonde während der extension-Phase gebunden bleiben muss. Die real-
time PCR wurde in allen Versuchen, falls nicht anders beschrieben, nach folgendem
Protokoll durchgeführt:
Tabelle 7: Amplifikationsprotokoll der real-time PCR
Zyklen (n) Temperatur (°C) Zeit (s)
1
first denaturation und
hot start
45 annealing und
58
95 600
denaturation 95 15
extension
60 60
Jede konventionelle PCR wurde, falls nicht anders beschrieben, nach folgendem
Amplifikationsprotokoll durchgeführt:
Tabelle 8: Amplifikationsprotokoll der konventionellen PCR
Zyklen (n) Temperatur (°C) Zeit (s)
1 first denaturation 94 120
35
denaturation 94 15
annealing 55,9 – 61,9 60
extension 72 30
1 final extension 72 600