Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

5.1.3 Quantifizierungsmethode
Diskussion
Eine Quantifizierung von GE mittels real-time PCR kann absolut oder relativ erfolgen.
Für eine absolute Quantifizierung sollte in jeder PCR eine Standardkurve erstellt
werden (LARIONOV et al. 2005), wodurch jedoch der materielle Aufwand und die
Arbeitszeit je Probe erheblich ansteigen. Die Kosten für die Untersuchung einer
einzigen Probe können dadurch soweit steigen, dass ein quantitatives Testsystem für
die Routinediagnostik „unbrauchbar“ wird. Die relative Quantifizierung, die in der
Regel als reverse-transcription real-time PCR angewendet wird, hat häufig zum Ziel,
die Expression eines Zielgens mit der eines Referenzgens zu vergleichen (PFAFFL
2004). Die relative Menge des Zielgens wird anschließend, normiert auf einen
Kalibrator, im Vergleich zu einer Kontrolle kalkuliert. Für eine absolute
Quantifizierung bakterieller DNA, wie sie in der vorliegenden Untersuchung
durchgeführt werden sollte, konnte diese Art der Quantifizierung nicht ohne
Änderungen übernommen werden. Für die hier beschriebene real-time PCR wurde
ein Vergleich des Ct-Wertes für eine Referenzmenge (Standard „S3“) mit dem Ct-
Wert der Proben vorgenommen. Dazu wurde das ∆∆Ct aus dem ∆Ct für den
Standard und dem ∆Ct für die jeweilige Probe gebildet und durch die negative
Steigung der Standardkurve der real-time PCR dividiert. Dieser Wert ist, als
Exponent zur Basis 10, mit der Menge von GE im Standard (hier 10 3 GE / µl) zu
multiplizieren, um die Konzentration von GE in der Probe zu berechnen. Eine
ähnliche Strategie zur Quantifizierung wurde bereits von anderen Autoren
beschrieben. In dem Fall wurde die relative Expression eines Zielgens nur anhand
der PCR-Effizienzen und des ∆∆Ct von Kontrolle und Probe berechnet. Diese
Methode setzt voraus, dass die Effizienzen der Amplifikation der Zielsequenz und
des Referenzgens bekannt oder gleich sind (PFAFFL 2001). In der real-time PCR
zum Nachweis spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis basiert der
Standard resp. das „Referenzgen“ auf Plasmiden, die ein Insert tragen, dass 450 bp
größer ist als die Zielsequenz. Diese neben der eigentlichen Zielsequenz der PCR
vorhandenen bp sind identisch mit den bp im Genom von L. intracellularis und sollen
im Plasmid stöchometrische Verhältnisse herstellen, wie sie auch im Genom des
Wildtyps vorliegen. Diese strukturell ähnlichen Verhältnisse in Plasmid und Genom
lassen erwarten, dass die Effizienzen der Amplifikation, die unter anderem von der
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