Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...
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Literaturübersicht<br />
<strong>von</strong> der Software, die das <strong>real</strong>-<strong>time</strong> PCR Gerät steuert und die Messdaten empfängt,<br />
in Abhängigkeit <strong>von</strong> der baseline berechnet und gilt in der Regel für jede<br />
Reaktionseinheit in einem PCR-Ansatz (BUSTIN u. NOLAN 2004). Der threshold<br />
liegt graphisch betrachtet immer oberhalb der baseline, jedoch so niedrig, dass er als<br />
Gerade die Amplifikationskurve in der Exponentialphase schneidet (ANON. 2005a).<br />
Der Zyklus, in dem die normierte und baseline-korrigierte Reporterfluoreszenz ∆Rn<br />
diesen threshold überschreitet, wird als Ct bezeichnet (ANON. 2005a, HEID et al.<br />
1996). Der Ct-Wert ist umgekehrt proportional zur Anzahl der target-Sequenzen in<br />
der Probe; das heißt je höher die ursprüngliche Konzentration der Ziel-DNA in der<br />
Probe, desto niedriger ist der entsprechende Ct-Wert (BUSTIN 2005).<br />
Die <strong>von</strong> der Software berechneten Ergebnisse müssen interpretiert und ihrer Validität<br />
überprüft werden. In einem PCR-Assay können immer falsch-positive wie auch<br />
falsch-negative Ergebnisse erzeugt werden. Beide Fehler sollten mit einer hohen<br />
Wahrscheinlichkeit identifiziert werden (BURKARDT 2000).<br />
Falsch-positive Ergebnisse können während der PCR durch unspezifische<br />
Amplifikation, Kontamination und/oder Verdunstung entstehen. Zur Verifizierung<br />
dieser Fehler muss in jedem PCR-Ansatz auch eine Negativkontrolle untersucht<br />
werden (BURKARDT 2000). Diese Negativkontrolle (non template control (NTC))<br />
enthält alle Reagenzien des Reaktionsmixes, jedoch wird keine target-DNA zugefügt<br />
(MALORNY et al. 2003). Ist diese Negativkontrolle positiv, so muss der jeweilige<br />
Ansatz wiederholt werden (BURKARDT 2000). Darüber hinaus sollte eine negative<br />
Extraktionskontrolle untersucht werden, die in allen Bearbeitungsschritten - <strong>von</strong> der<br />
DNA-Extraktion bis zur PCR - wie eine normale Probe behandelt wird (MALORNY et<br />
al. 2003). Es gibt die Möglichkeit, dass eine Negativkontrolle einen Ct-Wert besitzt,<br />
obwohl sie tatsächlich negativ ist. Hier sind vor allem die Geräteinstellungen<br />
hinsichtich baseline und threshold zu überprüfen und die Interpretation der<br />
Ergebnisse entsprechend anzupassen (BUSTIN u. NOLAN 2004).<br />
Falsch-negative Ergebnisse können unter anderem durch Inhibitionen der PCR<br />
entstehen. Zur Identifizierung dieser Tatsache wird in jedem Ansatz eine<br />
Positivkontrolle untersucht. Ist diese negativ, sind die Testergebnisse nicht gültig<br />
(BURKARDT 2000). Es wird eine positive Extraktionskontrolle empfohlen, die aus<br />
einer negativen Probe besteht und mit Ziel-DNA gespickt ist. Auch diese Kontrolle<br />
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