Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Literaturübersicht
von der Software, die das real-time PCR Gerät steuert und die Messdaten empfängt,
in Abhängigkeit von der baseline berechnet und gilt in der Regel für jede
Reaktionseinheit in einem PCR-Ansatz (BUSTIN u. NOLAN 2004). Der threshold
liegt graphisch betrachtet immer oberhalb der baseline, jedoch so niedrig, dass er als
Gerade die Amplifikationskurve in der Exponentialphase schneidet (ANON. 2005a).
Der Zyklus, in dem die normierte und baseline-korrigierte Reporterfluoreszenz ∆Rn
diesen threshold überschreitet, wird als Ct bezeichnet (ANON. 2005a, HEID et al.
1996). Der Ct-Wert ist umgekehrt proportional zur Anzahl der target-Sequenzen in
der Probe; das heißt je höher die ursprüngliche Konzentration der Ziel-DNA in der
Probe, desto niedriger ist der entsprechende Ct-Wert (BUSTIN 2005).
Die von der Software berechneten Ergebnisse müssen interpretiert und ihrer Validität
überprüft werden. In einem PCR-Assay können immer falsch-positive wie auch
falsch-negative Ergebnisse erzeugt werden. Beide Fehler sollten mit einer hohen
Wahrscheinlichkeit identifiziert werden (BURKARDT 2000).
Falsch-positive Ergebnisse können während der PCR durch unspezifische
Amplifikation, Kontamination und/oder Verdunstung entstehen. Zur Verifizierung
dieser Fehler muss in jedem PCR-Ansatz auch eine Negativkontrolle untersucht
werden (BURKARDT 2000). Diese Negativkontrolle (non template control (NTC))
enthält alle Reagenzien des Reaktionsmixes, jedoch wird keine target-DNA zugefügt
(MALORNY et al. 2003). Ist diese Negativkontrolle positiv, so muss der jeweilige
Ansatz wiederholt werden (BURKARDT 2000). Darüber hinaus sollte eine negative
Extraktionskontrolle untersucht werden, die in allen Bearbeitungsschritten - von der
DNA-Extraktion bis zur PCR - wie eine normale Probe behandelt wird (MALORNY et
al. 2003). Es gibt die Möglichkeit, dass eine Negativkontrolle einen Ct-Wert besitzt,
obwohl sie tatsächlich negativ ist. Hier sind vor allem die Geräteinstellungen
hinsichtich baseline und threshold zu überprüfen und die Interpretation der
Ergebnisse entsprechend anzupassen (BUSTIN u. NOLAN 2004).
Falsch-negative Ergebnisse können unter anderem durch Inhibitionen der PCR
entstehen. Zur Identifizierung dieser Tatsache wird in jedem Ansatz eine
Positivkontrolle untersucht. Ist diese negativ, sind die Testergebnisse nicht gültig
(BURKARDT 2000). Es wird eine positive Extraktionskontrolle empfohlen, die aus
einer negativen Probe besteht und mit Ziel-DNA gespickt ist. Auch diese Kontrolle
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