Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

5 Diskussion
Diskussion
Die vorliegende Untersuchung wurde mit dem Ziel durchgeführt, eine real-time PCR
zum Nachweis spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis in Kotproben zu
entwickeln. Die Methode soll über die einfache Detektion hinaus eine absolute
Quantifizierung der Erregermenge im Probenmaterial erlauben. Im Anschluss an die
Entwicklung der real-time PCR sollte die Methode in Anlehnung an national und
international anerkannte Empfehlungen und Richtlinien validiert werden.
Abschließend wurden mögliche Einflüsse auf das quantitative Ergebnis, wie etwa die
Verteilung des Erregers in der Probenmatrix sowie Dauer und Temperatur während
der Probenlagerung untersucht.
5.1 Etablierung und Validierung
5.1.1 Testsystem
Die PCR ist die am häufigsten verwendete Methode zum Nachweis spezifischer
DNA-Abschnitte (MACKAY 2004). Die Detektion von PCR-Produkten kann
konventionell im Anschluss an die PCR mit einer Gelelektrophorese und der
anschließenden Färbung der DNA oder real-time mittels fluoreszierender Farbstoffe
bzw. Sondentechnologie erfolgen. In der vorliegenden Untersuchung wurde die real-
time PCR in Kombination mit der Sondentechnologie als Testsystem verwendet, da
dieses Verfahren gegenüber der konventionellen PCR zahlreiche Vorteile bietet. Eine
real-time PCR erfordert zum einen keine weitere Behandlung der PCR-Produkte,
wodurch das Risiko einer Kontamination minimiert wird (SCHMITTGEN 2001,
MACKAY 2004). Zum anderen führt die real-time PCR innerhalb weniger Stunden zu
einem Ergebnis (SCHMITTGEN 2001) und ermöglicht so eine deutliche
Zeiteinsparung gegenüber der konventionellen PCR. Der größte Vorteil der real-time
PCR liegt jedoch in der Möglichkeit, die ursprüngliche Menge spezifischer DNA in
einer Probe zu quantifizieren (BUSTIN 2005).
Zur Visualisierung der PCR-Produkte wurde in dieser Untersuchung ein spezifisches
Detektionssystem, die TaqMan-Sonde, verwendet. Diese Sonde erzeugt nur in
120