Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Material und Methoden
Tabelle 25: Reaktion zur Verdünnungsreihe
DNA-template: Plasmid-DNA
Aufgereinigt mit: PureLink Hipure Plasmid Maxiprep Kit
Reaktionsmix:
12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix 2x
10 µl Primer- Mix
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: keine
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für FAM
Der Standard, der zur Validierung in den folgenden real-time PCRs verwendet
werden sollte, wurde nach zwei Kriterien ausgewählt. Zum einen sollte die
Standardabweichung in dieser Konzentrationsstufe niedrig sein und zum zweiten
sollte der Ct-Wert des Standards exakt auf der Standardkurve liegen. Die Erfüllung
dieser Kriterien lassen erwarten, dass der Ct-Wert für jeden Standard nahe seinem
eigenen Mittelwert liegt und die Reaktion eine hohe Reproduzierbarkeit hat. Aus dem
Eluat der Plasmidpräparation wurden insgesamt 50 ml des Standards durch
Verdünnen mit LiChrosolv ® hergestellt, zu 50 µl in EC 1.5 aliquotiert und im
Tiefkühlgefrierschrank bei -70 °C eingefroren.
3.2.13 Quantifizierung
Bezugspunkt für die Quantifizierung spezifischer Genomfragmente von L.
intracellularis in Probenmaterial war der Ct-Wert des Standards. Dieser Wert musste
für eine valide Kalkulation innerhalb der einfachen Standardabweichung aus den
Vorversuchen liegen. Die Differenz zwischen den Ct-Werten der Proben und dem Ct-
Wert des Standards wurden als ∆∆Ct angegeben. Da in jedem Zyklus dieser real-
time PCR die Menge an PCR-Produkt nahezu verdoppelt wird, ist nach 3,3293
(negative slope dieser real-time PCR; für die Berechnungen aufgerundet auf 3,33)
Zyklen eine Verzehnfachung der Zielsequenz zu erwarten. Die Menge von GE in
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