Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Diskussion
Inhibitoren während der Probenaufbereitung durchgeführt werden (ANON. 2005b).
Die in dieser Arbeit beschriebene Methode schließt eine externe
Amplifikationskontrolle, eine interne Amplifikationskontrolle und eine
Probenaufbereitung zur Entfernung von Inhibitoren ein (DNA-Extraktion mittels
QIAamp ® DNA Stool Mini Kit). Durch die Probenaufbereitung nach dem genannten
Verfahren können Inhibitoren aus Kot mit einer angemessenen Sicherheit entfernt
werden (NATHUES 2007). Das QIAamp ® DNA Stool Mini Kit war in einer
vergleichenden Untersuchung anderen Methoden einer Probenaufbereitung durch
Kochen oder Phenol/Chlorophorm-Präzipitation deutlich überlegen (JACOBSON et al.
2004). Durch die adäquate Probenaufbereitung und sichere Entfernung von
Inhibitoren kann die Sensitivität der PCR an Kotproben zum Nachweis spezifischer
Genomfragmente von L. intracellularis von 38 % auf 88,2 % gesteigert werden
(KNITTEL et al. 1997, SUH et al. 2000).
Während der gesamten Untersuchung konnte, wenn keine spezifischen
Genomfragmente von L. intracellularis in den Proben nachzuweisen waren, eine
Amplifikation der IPC-DNA festgestellt werden. In Übereinstimmung mit früheren
Untersuchungen kann davon ausgegangen werden, dass mit der Probenaufbereitung
Inhibitoren sicher entfernt wurden. Da die Sensitivität und die Effizienz einer PCR
häufig durch Inhibitoren beeinflusst werden (WILSON 1997), weisen auch die hohe
Sensitivität und die hohe Effizienz der real-time PCR auf eine Abwesenheit
inhibitorischer Substanzen in der Reaktion hin. Durch die Verwendung der IPC
wurden exogene DNA und die entsprechenden Primer in die Reaktion eingebracht.
Um den möglichen Einfluss der Koamplifikation zu minimieren, wurde lediglich eine
minimale Menge der IPC eingesetzt, die weit unter der vom Hersteller empfohlenen
Konzentration liegt, eine Amplifikation aber gerade noch erkennen lässt. Trotzdem
musste überprüft werden, dass auch diese Koamplifikation nicht zu einer
Beeinflussung der Amplifikation von Ziel-DNA führt. Solch ein Einfluss könnte die
Effizienz der eigentlichen real-time PCR herabsetzen und die Ergebnisse verfälschen
(BANGSOW et al. 2007). Anhand der Untersuchung von Plasmiden in
unterschiedlichen Konzentrationen sowohl mit als auch ohne IPC konnte gezeigt
werden, dass es zu keiner signifikanten Abweichung der Ct-Werte in der jeweiligen
Konzentrationsstufe kam. Aus diesem Grund kann davon ausgegangen werden,
dass die Amplifikation der IPC-DNA keinen Einfluss auf die Effizienz der real-time
PCR hat.
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