Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Material und Methoden
Von den Proben wurden je zwei Gramm in zwei verschiedene Probengefäße
gegeben. Die Proben wurden mit 100 µl resp. 1 µl (zuzüglich 99 µl LiChrosolv ® ) einer
Lösung mit dem Referenzstamm Lawsonia intracellularis MS B3903 (siehe Kapitel
3.2.2) vermengt. Die Proben wurden mit einem Kotlöffel (Stuhlröhre; Sarstedt AG &
Co) eine Minute lang manuell homogenisiert und anschließend zu 200 mg Kot in ein
EC 2.0 eingewogen (Analysenwaage AC 120 S-ODI, Sartorius AG, D-37075
Göttingen). Aus drei Teilproben je Tier und Verdünnungsstufe wurde die DNA mit
dem QIAamp ® DNA Stool Mini Kit isoliert. Die DNA-Extrakte wurden bis zur weiteren
Bearbeitung im Tiefkühlgefrierschrank bei -70 °C ge lagert.
Die Menge des Referenzstamms von L. intracellularis in 1 ml der Lösung wurde
mittels real-time PCR quantifiziert (siehe Kapitel 3.2.13; PCR wie in Tab. 34).
Ausgehend von diesem Ergebnis konnte die Konzentration von GE pro ml
Referenzlösung bestimmt werden.
Die Ergebnisse der real-time PCR (Tab. 33) an Kotproben und dem Referenzstamm
wurden in der Software Microsoft Office Excel 2003 erfasst und vergleichend
ausgewertet. Die Wiederfindungsrate entspricht dem Quotienten aus der detektierten
Menge von GE und der zugegebenen Menge von GE in denselben Proben. Die
mittlere Wiederfindungsrate ist der arithmetische Mittelwert aller einzelnen
Quotienten.
Tabelle 32: Protokoll der PCR zur Untersuchung von Kotproben auf den Gehalt von
DNA-template:
Genomäquivalenten von L. intracellularis
Proben von Schweinen mit unbekanntem
Infektionsstatus
Aufgereinigt mit: QIAamp ® DNA Stool Mini Kit
Reaktionsmix:
12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix 2x
9 µl Primer- Mix
0,8 µl Exo IPC Mix 10x
0,2 µl Exo IPC DNA 50x
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: keine
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für FAM
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