Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Material und Methoden
Die PCR-Produkte wurden mittels QIAquick ® PCR Purification Kit aufgereinigt und
die DNA-Menge spektralphotometrisch bestimmt. Anschließend wurden die
Oligonukleotide in einen Vektor (TOPO TA Cloning ® Kit, pCR ® 2.1-TOPO ® Vector,
Part no. 45-0641, Lot no. 371947, Invitrogen, Carlsbad, CA 92008 USA) ligiert. In
Abhängigkeit des DNA-Gehalts wurden 2 bzw. 3 µl des eluierten PCR-Produkts, 1 µl
Salt-Solution, 1 µl TOPO-Vektor und Wasser ad 6 µl (alles im TOPO TA Cloning ® Kit,
Invitrogen) verwendet und gemischt.
Weitere Reaktionsschritte:
• fünf Minuten Inkubation bei Raumtemperatur
• fünf Minuten Inkubation auf Eis
• Zugabe von je 2 µl des Reaktionsgemisches auf je eine Einheit One Shot ®
E.coli (TOP 10, Lot: 285067; Invitrogen)
• 30 Minuten Inkubation auf Eis
• Hitzeschock-Behandlung der Zellen für 45 Sekunden bei 42 °C ohne Schütteln
auf einem Thermoblock
• fünf Minuten Inkubation auf Eis
• Zugabe von 250 µl S.O.C.-Medium (Cat. No. 15544034; Invitrogen) zu den
Zellen und eine Stunde Schütteln bei 37 °C auf dem Thermoblock
Nach dem letzten Inkubationsschritt wurden je 50 µl bzw. 200 µl der transformierten
Zellen auf vorgewärmte Luria-Bertani (LB)-Nährboden (imMediaAmp Blue, Cat #
Q602-20, Lot: 1320686; Invitrogen) ausgespatelt und für 14 Stunden bei 37 °C
bebrütet. Von jedem Nährboden wurden dann 10 weiße Kolonien selektiert und in 5
ml Flüssigmedium (imMedia Amp liqiud, Part no. 45-0035, Lot no. 402120;
Invitrogen) überimpft. Dieses Flüssigmedium wurde für 12 Stunden bei 37 °C auf
einem Schüttler im Brutschrank inkubiert.
Der Erfolg der Transformationen wurde anhand der Ergebnisse einer PCR überprüft.
Dazu wurden je 2 ml Medium in einem EC 2.0 für 5 Minuten bei 8000 g zentrifugiert
(Centrifuge 5415 C, 39995, Eppendorf AG). Die plasmidale DNA aus den
Bakterienpellets wurde mit dem QIAprep ® Spin Miniprep Kit (Cat. No. 27104, Lot. No.
127155772; Qiagen GmbH) entsprechend den Herstellerangaben isoliert.
Abschließend erfolgte eine Untersuchung der Proben mittels real-time PCR (Tab. 23).
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