Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Material und Methoden
3.2.16 Diagnostische Sensitivität und Spezifität
Die diagnostische Sensitivität resp. Spezifität ist der Anteil der vom Test positiv resp.
negativ bewerteten Proben an den tatsächlich positiven resp. negativen Proben. Als
Vergleichsuntersuchung für die real-time PCR wurde wurde eine multiplex-PCR
(NATHUES 2007), die in der Routinediagnostik eingesetzt wird, herangezogen.
Die DNA von Kotproben, die im Rahmen der Routinediagnostik im Labor der
Außenstelle für Epidemiologie mittels multiplex-PCR auf spezifische
Genomfragmente von B. hyodysenteriae, B. pilosicoli und L. intracellularis
(NATHUES 2007) untersucht wurden, sind im Anschluss an die Untersuchung
getrennt nach Untersuchungsergebnis in einem Gefrierraum bei -20 °C
kryokonserviert worden. Aus Material, das zwischen Januar 2006 und August 2007
eingelagert wurde, sind nach dem einfachen Losverfahren 150 L. intracellularis-
positive und 150 L. intracellularis-negative DNA-Extrakte ausgewählt worden. Die
Proben wurden anschließend alternierend sortiert und neu beschriftet. Die
spezifischen GE von L. intracellularis wurden mittels real-time PCR quantifiziert (Tab.
30).
Tabelle 30: Protokoll der PCR zur Feststellung der diagnostischen Sensitivität und
DNA-template:
der diagnostischen Spezifität
Proben natürlich infizierter und nicht infizierter
Schweine
Aufgereinigt mit: QIAamp ® DNA Stool Mini Kit
Reaktionsmix:
12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix 2x
9 µl Primer- Mix
0,8 µl Exo IPC Mix 10x
0,2 µl Exo IPC DNA 50x
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: keine
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für FAM
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