Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Material und Methoden
3.2.6 Überprüfung der analytischen Spezifität der Primer
Die analytische Spezifität der Primer Li-Ubi-F und Li-Ubi–R wurde mittels PCR an
template-DNA verschiedener Referenzstämme solcher Erreger überprüft, die in
großer Menge beim Schwein vorkommen können. Die Primer sollen ausschließlich
ein spezifisches Genomfragment von L. intracellularis amplifizieren und mit keiner
anderen DNA ein PCR-Produkt bilden. Die isolierte DNA der Referenzstämme wurde
wiederholt in PCRs verwendet und die Ergebnisse mittels dem SYBR ® Green-
System visualisiert (Tab. 13 und 14). Der Reaktionsmix setzte sich aus 12,5 µl Power
SYBR ® Green PCR Master Mix (P/N: 4367659, L/N: 0704057; Applied Biosystems),
Wasser, den Primern und 2,5 µl template-DNA zusammen. Die real–time PCR wurde
qualitativ und in der absoluten Quantifizierung ausgewertet.
Tabelle 13: Protokoll der PCR (I) zur Überprüfung der analytischen Spezifität der
Primer
DNA-template: Lawsonia intracellularis MS B3903
Referenzstämme
Aufgereinigt mit: DNeasy ® Blood & Tissue Kit
Reaktionsmix:
NucleoSpin ® Tissue Kit
12,5 µl Power SYBR ® Green PCR Master Mix 2x
2,25 µl Primer Li-Ubi F (10 pmol/ µl)
2,25 µl Primer Li-Ubi-R (10 pmol/ µl)
5,5 µl Wasser
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: keine
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für SYBR ® Green
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