Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Literaturübersicht
Die Lyse von Zellen kann durch eine Hitzebehandlung erfolgen. Allerdings kann es
nach einfachem Kochen zum Abbau von template und/oder PCR-Produkten durch
thermostabile Nucleasen kommen. Die zusätzliche Verwendung von
Natriumhydroxid/Sodiumdodecylsulfat (NaOH/SDS) kann nach einer
Hitzebehandlung die Degradation von Amplifikaten verhindern (RASMUSSEN et al.
1994). Da allein durch Kochen die DNA nicht von Struktur- und DNA-bindenden
Proteinen getrennt wird und die Lysis selbst auch mangelhaft sein kann, haben
PCRs mit diesem Ausgangsmaterial häufig eine geringe Sensitivität (WILSON 1997).
Aus diesem Grund ist die Verwendung von Enzymen wie bspw. Proteinase K
notwendig, die über ein breites Spektrum proteolytisch wirken und so die Entfernung
von Proteinen aus DNA und die Zerstörung DNA-degradierender Enzyme
ermöglichen. Eine Verbesserung der Proteolyse kann durch Zugabe von SDS
erreicht werden (GROSS-BELLARD et al. 1973). Auch Lysozym kann zur
enzymatischen Lyse verwendet werden (MILLER et al. 1999).
Detergentien können ebenfalls die Lysis von Zellen fördern. Häufig wird dazu die
Verwendung von SDS in die Protokolle integriert (ZHOU et al. 1996). Andere
Substanzen zur Zelllysis enthalten Natriumchlorid oder verschiedene Puffer (MILLER
et al. 1999).
Nach der Lyse der Zellen erfolgt die Aufreinigung der DNA. Eine Präzipitation von
DNA kann durch Zugabe von Ethanol erreicht werden (MILLER et al. 1988).
Isopropanol, Polyethylenglykol oder Trichloressigsäure können ebenfalls zur DNA-
Fällung eingesetzt werden. Nachfolgend wird die Matrix zentrifugiert und gewaschen.
Die so erhaltene DNA wird in einem geeigneten Puffer aufgenommen (FRECH et al.
2007). In diesem Puffer ist DNA über lange Zeit bei -20 °C haltbar (SETZKE 2007).
Eine andere Möglichkeit der Aufreinigung ist die Phenolextraktion. Dabei reichert sich
die DNA in der Chloroformphase an; Proteine kumulieren dagegen in der
Phenolphase. Die so isolierte DNA hat als template eine mittlere Qualität. Hochreine
DNA kann durch Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation separiert werden
(FRECH et al. 2007, GRIESS et al. 2007).
Moderne Techniken zur DNA-Aufreinigung basieren auf Silikagel- oder auf die
Anionenaustauschchromatographie. Die DNA bindet an die entsprechenden
Oberflächen und kann mit speziellen Puffern gewaschen werden. Die Entfernung der
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