Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Spezifische Detektionssysteme
Literaturübersicht
Die spezifische Detektion von Amplifikaten basiert auf der Verwendung sequenz-
spezifischer Hybridisierungssonden, die mit fluoreszierenden Farbstoffen gelabelt
sind. Üblicherweise werden Farbstoffe wie Fluorescein, Rhodamin und
Cyaninfarbstoffe und/oder deren Derivate eingesetzt (BUSTIN u. NOLAN 2004).
Zurzeit sind diverse Farbstoffe mit verschiedenen Anregungs- und
Emissionsspektren im Handel erhältlich und können individuell nach Kundenwunsch
an Oligonukleotide gebunden werden (MARRAS 2008). Für jede Zielsequenz ist die
Verwendung einer separaten Sonde nötig. Durch die Auswahl verschiedener
Farbstoffe können mit dieser Art der Detektion real-time multiplex-PCRs durchgeführt
werden (BUSTIN u. NOLAN 2004).
Unspezifische Amplifikate und/oder Primer-Dimere werden nicht visualisiert, da eine
Fluoreszenz nur nach Hybridisierung der Sonde an die komplementäre target-
Sequenz auftritt. Diese hohe Spezifität kann zugleich ein Nachteil sein, da bspw.
unspezifische Amplifikate nicht detektiert werden und ihr möglicher negativer Einfluss
auf die Effizienz der eigentlichen Amplifikation unerkannt bleibt. Viele
Sondensysteme beruhen auf dem Prinzip des fluorescence resonance energy
transfer (FRET) (BUSTIN u. NOLAN 2004). Das FRET-Prinzip wurde 1988 erstmals
zur Detektion von Nukleinsäuren eingesetzt. Damals wurde ein fluoreszierender
Farbstoff sowohl als Donor wie auch als Akzeptor verwendet (CARDULLO et al.
1988). Heute ist der Akzeptor häufig ein Quencher-Molekül, das nach Anregung die
Energie nicht in Form von Licht, sondern als Wärme abgibt (MARRAS 2008,
KUBISTA et al. 2006).
Der Energietransfer und die Auslöschung des Signals sind beim FRET abhängig von
der Entfernung zwischen Donor und Akzeptor. Der Donor emittiert ein Photon, das
vom Akzeptor aufgenommen wird. Auf diese Weise wird ein Fluoreszenzsignal
(emittiertes Licht) des Donors verhindert. Durch räumliche Umordnung der Sonde
wird die Entfernung zwischen Donor und Akzeptor vergrößert und es kann ein
Fluoreszenzsignal entstehen. Wichtig ist, dass das Emissionsspektrum des Donors
mit dem Absorptionsspektrum des Akzeptors einen gemeinsamen Bereich aufweist
(KUBISTA et al. 2006, MARRAS 2008).
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