Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Material und Methoden
3.2.7 Optimierung der Sonden-Konzentration
Mit dem Ziel, eine möglichst hohe Amplitude der Amplifikationskurve zu erreichen,
wurde die Sonde in unterschiedlichen Konzentrationen im Reaktionsmix eingesetzt.
Um die optimale Konzentration zu bestimmen wurde die lyophilisierte Sonde in Tris-
EDTA Puffer aufgenommen, so dass eine 100 µM Stocklösung entstand. Die
Effektivität der PCR und Höhe der Amplitude wurde für Konzentrationen der Sonde
von 50 nM, 100 nM und 200 nM in der Reaktion überprüft (Tab. 15). Dazu wurde die
Stammlösung der Sonde in Tris-EDTA Puffer zu einer Arbeitslösung verdünnt, mit
der im Reaktionsmix die jeweilige Endkonzentration einzustellen war. Der
Reaktionsmix enthielt darüber hinaus 12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix
(Part Number: 4304437, Roche Molecular Systems, Branchburg, New Jersey, USA).
Die PCR wurde im real-time Cycler in der absoluten Quantifizierung durchgeführt.
Der Versuch wurde zwei Mal wiederholt.
Tabelle 15: Protokoll der PCR zur Überprüfung der optimalen Konzentration der
Sonde
DNA-template: Lawsonia intracellularis MS B3903
Aufgereinigt mit: DNeasy ® Blood & Tissue Kit
Reaktionsmix:
12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix 2x
2,5 µl Primer Li-Ubi F (5 pmol/ µl)
2,5 µl Primer Li-Ubi-R (5 pmol/ µl)
2,5 µl Wasser
2,5 µl Li-Ubi-Probe (0,5 resp. 1 resp. 2 pmol/ µl)
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: Zyklen: 40 statt 45
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für FAM
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