Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Diskussion
5.1.4 Nachweis- und Quantifizierungsgrenzen sowie Effizienz
Die untere Nachweis- resp. Quantifizierungsgrenze ist definiert als kleinste Menge
des Analyten, die noch detektiert resp. mit ausreichender Präzision quantifiziert
werden kann (ANON. 1998b). Die Nachweisgrenze einer real-time PCR zum
Nachweis spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis wurde mit 4 x 10 4 GE
pro Gramm Kot resp. 1 GE pro Reaktion angegeben (LINDECRONA et al. 2002). In
einer multiplex-PCR zum Nachweis von L. intracellularis, B. hyodysenteriae und B.
pilosicoli wurde die Nachweisgrenze für alle drei Erreger mit 10 2 bis 10 3 Bakterien
pro Gramm Kot angegeben, wobei die Bande der PCR-Produkte bei einem Gehalt
von 10 2 Bakterien pro Gramm Kot nach der Gelelektrophorese nur sehr schwach zu
erkennen war (LA et al. 2006). Die Ergebnisse dieser Studie sind kritisch zu
bewerten, da sie voraussetzen, dass nach Zugabe von 10 2 Erregern zu 200 mg Kot
die Wiederfindungsrate der spezifischen Genomfragmente nach Extraktion der DNA
mittels QIAamp ® DNA Stool Mini Kit 100 % beträgt. Diese Ausbeute ist jedoch
aufgrund einer limitierten DNA Bindungskapazität der Säule im Kit nicht möglich
(pers. Mitteilung Dr. Klug, Qiagen, 10.10.2007). Nur wenn in den Kotproben keine
weitere DNA vorhanden gewesen wäre, hätten 100 % der zugegebenen DNA wieder
isoliert werden können. Unter dieser Voraussetzung müsste die Sensitivität der PCR
etwa 1-5 GE pro Reaktion betragen, was nach heutigem Kenntnisstand für eine
multiplex-PCR sehr unwahrscheinlich ist. Eine mögliche Erklärung für diese
Ergebnisse könnte die Bestimmung der Keimzahl mittels IFT vor der Präparation der
Proben sein. Wenn mit dieser Methode nicht jede Zelle mit einem Antikörper markiert
ist, wird die Anzahl der Zellen zwangsläufig unterschätzt. Darüber hinaus färbt der
Antikörper nur Antigen auf der Zelloberfläche an und nicht DNA bereits im Abbau
befindlicher Zellen von L. intracellularis. Diese - unter Umständen im IFT nicht
detektierten - Zellreste können noch intakte DNA enthalten und so in der PCR zu
einer Amplifikation führen. Auch hier „unterschätzt“ der IFT die Anzahl von L.
intracellularis in der Probenmatrix.
Die Nachweisgrenze für L. intracellularis in der multiplex-PCR, die als
Vergleichsmethode zur Feststellung der diagnostischen Sensitivität und Spezifität
herangezogen wurde, beträgt 10 3 GE pro ml Plasmidlösung (NATHUES 2007). Diese
Plasmidlösung, die als Ausgangsmaterial diente, wurde durch die Verwendung eines
Säulenkits um den Faktor 20 konzentriert (Elution nach Aufreinigung von einem
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