1 EINLEITUNG

33 Tiere, Material und Methoden
zum Creatiningehalt der Urinprobe ist, wird nach einer vorgegebenen Zeitspanne
photometrisch erfaßt .
Hierzu wurde nach der Methode von BAHR et al. (2000) nach Auftauen und zweiminütigem
Homogenisieren auf dem Vortex eine Verdünnung der nativen Urinproben von 1:10 mittels
Aqua bidest. hergestellt. Nach der Herstellung einer achtstufigen Verdünnungsreihe
(1:10 µg/50µl bis 1:0,078 µg/µl) des Creatinin Standards und dem Pipettieren von jeweils
150 µl H2O als blank und 50 µl H2O als Nullstandard zero wurden die Verdünnungsreihe,
Qualitätskontrollen (jew. 50 µl hoch bzw. niedrig konzentrierte Creatinin-Lösungen) sowie
die verdünnten Proben (jew. 50 µl) auf eine Mikrotiterplatte pipettiert. Anschließend wurden,
mit Ausnahme des blank, jeweils 50 µl der alkalischen Pikratlösung in die gefüllten well der
Mikrotiterplatte pipettiert. Die mit einer Cellophanfolie verschlossene Mikrotiterplatte wurde
nun auf einen im Dunkeln stehenden Rüttler gleichmäßig bewegt. Die Messung der optischen
Dichte erfolgte nach 15 Minuten mittels eines Photometers bei 490 nm (Referenzfilter:
630 nm). Die Auswertung erfolgte dann mit Hilfe eines in dem Photometer installierten
automatischen Computerprogramms.
3.1.6.4 Gefriertrocknen und Pulverisieren von Kotproben
Alle Kotproben wurden zur Kompensation der unterschiedlichen Wassergehalte bei
20,3 mbar und – 20° C für drei bis fünf Tage gefriergetrocknet (Anlagentyp Alpha II-12,
Firma Christ). Die trockenen Fäzes wurden anschließend homogenisiert. Dieses geschah,
indem die Proben gemörsert und dabei größere unverdaute Fremdpartikel wie Obstkerne oder
Pflanzenfasern, Steine und Plastikteilchen entfernt wurden. Das gewonnene Kotpulver wurde
nun in das Plastikgefäß zurückgegeben und zur weiteren Lagerung bei – 20° C mit einem
Deckel luftdicht verschlossen.
3.1.6.5 Steroidextraktion aus dem Kot
Nach SCHWARZENBERGER et al. (1996) liegen Steroide im Kot zu einem hohen
Prozentsatz unkonjugiert vor, weshalb hier auf eine Hydrolyse verzichtet werden kann. Für
die Extraktion wurden etwa 50 mg Kotpulver in ein 15 ml Plastikröhrchen eingewogen, wobei
das exakte Gewicht jeder Probe vermerkt wurde. Jede Probe wurde mit 3 ml eines
Methanol/Wasser-Gemisches (80:20) versetzt und für 15 Minuten auf dem Multi Tube Vortex