1 EINLEITUNG

37 Tiere, Material und Methoden
jedes well mit 150 µl Streptavidin-Peroxidase-Lösung (20 ng/150 µl) befüllt und mit
Cellophanfolie verschlossen. Die verschlossene Platte wurde nun zu einer 30 Minuten langen
Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur auf einen Schüttler (MTS 4, Firma IKA-
Labortechnik) gestellt. Nach der Inkubation wurde die Platte wiederum gewaschen und
danach pro well mit 150 µl einer Zwei-Komponenten-Indikatorlösung (Lösung 1: 1,0 g
Wasserstoffperoxid-Harnstoff + 18 g Na2HPO4 x H2O + 10,3 g Citronensäure x H2O ad 1 l
H2O; Lösung 2: 0,5 g Tetramethylbenzidin + 40 ml DMSO + 960 ml H2O) befüllt. Nach
Verschließen der Mikrotiterplatte und einer 30 bis 50minütigen Inkubation bei
Raumtemperatur auf dem Schüttler im Dunkeln wurde die Farbreaktion durch Zugabe von
50 µl einer 2 mol/l H2SO4- Lösung pro well gestoppt. Die Extinktion wurde bei 450 nm
(Referenzfilter: 630 nm) mittels eines Photometers (MRX Revelation Microplate Reader,
Firma Dynatech Laboratories) gemessen. Ein integriertes Computerprogramm errechnete mit
Hilfe der Standardkurve die jeweiligen Steroidhormonkonzentrationen (pg/50µl) aus den
gemessenen Extinktionswerten.
Die Quantifizierung von Testosteronkonzentrationen im Urin erfolgte nach dem gleichen
Prinzip. Allerdings konnte durch die direkte Koppelung von Peroxidase an Testosteron
(Testosteron -3- (O-carboxymethyl) oxim-Peroxidase) auf den Schritt der Streptavidin-
Peroxidase Zugabe und Inkubation verzichtet werden. Die hier verwendete Testosteron -3-
(O-carboxymethyl) oxim-Peroxidase wurde mit Assaypuffer 1:30.000 verdünnt und der gegen
Testosteron-3-(O-carboxymethly)oxim-BSA eingesetzte Antikörper wurde in einer
Verdünnung von 1:2000 in den Assay eingesetzt. Die acht Verdünnungsstufen des
Testosteronstandards für die Kalibrierkurve lagen zwischen 20 pg/50 µl und 0,15 pg/50 µl.
Die Extrakte der Urinproben wurden in einer Verdünnung von bis zu 1:320 eingesetzt. Die
verwendeten Qualitätskontrollen hatten für den QC high eine Konzentration von 8 pg
Testosteron/50 µl Assaypuffer und für den QC low von 0,31 pg Testosteron/50 µl
Assaypuffer. Auch hier wurden die Steroidhormonkonzentrationen (pg/50 µl) aus den
gemessenen Extinktionswerten durch ein an das Photometer angeschlossenes
Computerprogramm errechnet.