Chlamydia pneumoniae - Universität zu Lübeck

Schutz der empfindlichen Zellen nicht statt. Zu definierten Zeitpunkten schloß sich je nach
Experiment die Isolierung der mRNA oder Western Blot Experimente an.
Das Ausmaß der Infektion wurde für jeden Versuch mikroskopisch kontrolliert. Dazu
erfuhren Deckgläschen in den Vertiefungen der Zellkulturplatten eine entsprechende
Beimpfung mit den jeweiligen Zellen und eine nachfolgende Infektion. Analog den
Zeitpunkten im Hauptversuch folgte im Anschluß die schon oben erwähnte
Immunfluoreszenzfärbung.
Inhibitoren der MAP-Kinasen:
MAP-Kinase Inhibitor Konzentration
phospho-p38 SB 203580 Calbiochem (Cat.No. 559389) 20 µmol
phospho-p44/42 (MEK 1/2) UO 126 Calbiochem (Cat.No.662005) 10 µmol
c-Jun N-terminal Kinase
(JNK)
JNK Inhibitor II Calbiochem (Cat.No. 420119) 10 µmol
2.5 Isolierung der mRNA
Die Isolierung der mRNA aus den jeweiligen Zellen erfolgte unter Verwendung des Nucleo
Spin RNA II Kit.
Zunächst war es nötig, die Zellen aus den Infektionsversuchen zu definierten Zeitpunkten
mittels einer Lösung aus einem mitgelieferten Lysispuffer und β-Mercaptoethanol
(Verhältnis 100:1) zu fixieren. Dazu wurde je Vertiefung einer 6-Loch-Platte 350 µl der
Lösung auf die Zellen pipettiert und diese durch den enthaltenen Lysispuffer gelöst. Die
entstandene gallertartige Substanz konnte nun bei einer Temperatur von –70 °C
eingefroren werden. Unter diesen Umständen war es möglich, nach und nach alle Proben
eines Versuches, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommen wurden, zu sammeln
und nach Erhalt der letzten Probe mit der eigentlichen RNA-Isolierung zu beginnen. Dazu
wurde in Anlehnung an das vom Hersteller vorgeschlagene Protokoll verfahren. Um
eventuell vorhandene DNA-Fragmente zu entfernen, wurde die extrahierte RNA mit einer
DNAse behandelt. Des weiteren folgte zum Schutz der Ribonucleinsäuren eine Inkubation
mit einem RNAse-Inhibitor. Nach erfolgter Extraktion lag die RNA in wäßriger Lösung vor.
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