Chlamydia pneumoniae - Universität zu Lübeck

2.11 Transfektion von siRNA in HCAEC
Dieser Versuch wurde als wesentliche Ergänzung der Infektionsversuche an
koronararteriellen Endothelzellen betrachtet. In HCAEC sollte die gezielte Ausschaltung
der ETAR-Expression mittels Transfektion spezifischer siRNA erfolgen.
Diese erst seit wenigen Jahren etablierte Methode erlaubt es, kleine interferierende RNA
(small/short interfering RNA, siRNA) in eukaryotische Zellen einzubringen und auf
elegante Weise, je nach Nucleotidsequenz, gezielt Genprodukte zu inhibieren. Dabei
interagiert die in die Zelle überführte, nur 20-25 Nucleotide umfassende siRNA mit dem
Multi-Protein-Komplex RISC (RNA induced silencing complex), der die gewünschte
Sequenz der mRNA erkennt und auftrennt. Die gespaltene mRNA wird degradiert und das
Genprodukt kann nicht exprimiert werden.
In 6-Loch-Zellkulturplatten wurden je Probe 400000 HCAEC eingesetzt. Es war
vorgesehen, die Zellen in die zuvor mit Gelatine beschichteten Vertiefungen der Platten
zu überbringen und für 24h in ihrem entsprechenden Anzuchtmedium bei 37°C und 5%
CO 2 im Brutschrank zu inkubieren. Um die Einbringung der siRNA in die Zellen zu
erleichtern, wurde das kationische Lipid Lipofectamine 2000 verwendet. Dies mußte
zunächst in einer Konzentration von 10 µg/ml für 5 Minuten bei Raumtemperatur in
DMEM-Medium verweilen.
Die spezifische siRNA für den Endothelin-A-Rezeptor mit der Sequenz 5’ - AAG AAA UAC
GCC AAA GUC AUU GUG A – 3’ wurde gemäß dem beiliegenden Protokoll mit RNasefreiem
Wasser resuspendiert, in einer Konzentration von 0.1 µM der Lipofectamine-
Lösung beigegeben und anschließend auf Eis gekühlt. Als Negativ-Kontrolle fungierte
RNA mit einem geringen Gehalt an Guanosin und Cytosin. Sie hatte eine entsprechende
Nucleotid-Komposition wie die eingesetzte siRNA, jedoch nicht deren Sequenz und
konnte somit nicht an der gewünschten Stelle der Ziel-mRNA binden. Sie wurde daher
auch als scrambled RNA bezeichnet und erfuhr die gleiche Vorinkubation wie die siRNA.
Nach 20 Minuten wurden die in Lipofectamine gelöste siRNA , bzw. scrambled RNA auf
die jeweiligen Proben gegeben und die Zellen für 2h im Brutschrank belassen.
Anschließend konnte die Lösung entfernt und die dafür vorgesehenen Zellproben mit
Chlamydia pneumoniae infiziert werden (0.5 IFU/Zelle).
Zu definierten Zeitpunkten nach 24h, bzw. 48h wurden die jeweiligen Proben der
Isolierung der RNA und der Transkription in cDNA zugeführt und anschließend mittels RT-
PCR analysiert und quantifiziert.
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