Chlamydia pneumoniae - Universität zu Lübeck
Chlamydia pneumoniae - Universität zu Lübeck
Chlamydia pneumoniae - Universität zu Lübeck
Erfolgreiche ePaper selbst erstellen
Machen Sie aus Ihren PDF Publikationen ein blätterbares Flipbook mit unserer einzigartigen Google optimierten e-Paper Software.
Anschließend wurde die RT-PCR nach folgendem Protokoll durchgeführt:<br />
Vorgang Dauer Temperatur<br />
Denaturierung 10 Minuten 95 °C<br />
45 Zyklen der<br />
Amplifikation:<br />
• Trennung der DNA-<br />
Doppelstränge<br />
(Denaturation)<br />
• Binden der Primer<br />
(Annealing)<br />
• DNA-Synthese<br />
(Extension)<br />
10 Sekunden 95 °C<br />
5 Sekunden 60 °C<br />
10 Sekunden 72 °C<br />
Die Bestimmung der mRNA Expression der jeweiligen Proteine auf den Wirtszellen<br />
erfolgte in Beziehung <strong>zu</strong>r Menge der ermittelten 18sRNA. Als Grundlage diente die von<br />
Winer et al. dargelegte Formel <strong>zu</strong>r Validierung von Real Time PCR Produkten 199 .<br />
x = 2 - ( ∆ 1 - ∆ 2 )<br />
x<br />
∆ 1<br />
∆ 2<br />
= n-fache Stimulation der mRNA Expression<br />
= (stimulierte Zellen) ET-1/ ETAR/ ETBR – (stimulierte Zellen) 18s<br />
= (unstimulierte Zellen) ET-1/ ETAR/ ETBR – (unstimulierte Zellen) 18s<br />
Reagenzien und Material:<br />
LightCycler ® Instrument Roche ®<br />
LightCycler FastStart DNA Master SYBR<br />
Green I<br />
Cat.No. 3 003 230, Roche Molecular<br />
Biochemicals<br />
18s, ET-1, ETAR, ETBR Oligo-Primer MWG-BIOTECH GmbH<br />
25
Change language