Wirkstoff-Substrat- Charakterisierung und Protein-Lokalisierung ...

3 Charakterisierung von Wirkstoffen und Wirkstoff-Substrat-Komplexen
3.2 Material und Methoden
3.2.1 Probenpräparation
Der Peptidrezeptor CBS-Lys-Lys-Phe-NH2 (1), das Tetrapeptid N-Ac-Glu-Glu-Glu-
Glu-OH (2) und das CBS-Amid wurden im Arbeitskreis von Prof. Schmuck syn-
thetisiert. Die für die Raman-Experimente eingesetzten Substanzen wurden mittels
MPLC (medium pressure liquid chromatography) gereinigt. Wässrige Rezeptorlösun-
gen wurden mit hochreinem Wasser (spezifischer Widerstand 18 MΩcm) hergestellt
und anschließend mit 1 M NaOH auf einen pH-Wert von 6 eingestellt.
3.2.2 Spektroskopische Methoden
Für die Raman-Studien wurden die Laserlinien eines Argonionen-Lasers (Spectra
Physics, Modell BeamLok 2085) im ultravioletten und im sichtbaren Spektralbereich
verwendet. Je nach Anregungswellenlänge variierte die Laserintensität auf den Pro-
ben zwischen 80 mW (275 nm) und 800 mW (458 nm). Die Raman-Spektren wurden
in einer 90 ◦ -Geometrie aufgenommen. Um eine photochemische Zersetzung der Pro-
ben zu verhindern, wurde die Drehküvetten-Technik eingesetzt. (82) Das Streulicht
wurde auf den Eingangsspalt eines Doppelmonochromators (Spex, Modell 1404 mit
2400 Strichen/mm holografischen Gittern) fokussiert und mit einer Stickstoff-gekühl-
ten CCD-Kamera (Photometrics, Modell SDS 9000, extended UV) detektiert. Die
Raman-Spektren wurden im Programm MAPS 2.0, unter Verwendung eines zweifa-
chen spektralen Überlapps mit der Scanning Multichannel-Technik SMT, (83) aufge-
nommen. Die Integrationszeit für jedes einzelne spektrale Fenster betrug bei allen
verwendeten Anregungswellenlängen ca. 4 Minuten. Als Standard wurden zusätz-
lich Cyclohexan-Spektren bei jeder Anregungswellenlänge aufgenommen, um eine
zuverlässige Wellenzahl-Kalibrierung für alle Spektren zu gewährleisten.
Absorptionsspektren wurden mit einem Spektralphotometer (Perkin-Elmer, Modell
Lambda 19 UV-VIS-NIR) mit einer Durchstimmgeschwindigkeit von 120 nm/min
aufgenommen.
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