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laborwelt
Nr. 1 / 2012 – 13. Jahrgang
Krebszellanalyse
Farbcode identifiziert
Krebszell-Klone
DNA Enrichment
Anreicherung von Zielgenen
mit Mikrofluidik-Chips
Zellbiologie
Neue Anwendungen für
die Durchflusszytometrie
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Inhalt
Laborwelt 1 / 2012
4 Nachrichten aus der Wissenschaft
Eingefrorene Pesterreger; Leuchtturm für Berlin; Biostrom aus der
Stratosphäre; Lehrgang in Kommunikation; Fortgeschrittenes Tumorimaging;
Forscher bauen Hefemagnete; Evolution: DNA springt mit; Auf den Spuren
der Urmenschen
36 Labormarkt im Umbruch
Qiagen schrumpft sich gesund
Krebszellanalyse
TITEL:
Krebszellenanalyse
Brustkrebszellen, die bei der
Operation übersehen werden, sind
der Hauptgrund für eine schlechte
Prognose. Deutsche und holländische
Experten entwickeln derzeit ein
Verfahren, das die Krebszellen schon
bei der OP sichtbar macht (S. 19)
I
Wissenschaft Technologie
17 Auffinden einer Mutation für erblichen Hörverlust mit Capture Arrays
Burkhard Ziebolz, Roche Applied Science, Penzberg
Blitzlicht Fertigung
20 Kunststoff-Know how: Basis für Lab-on-Chips zur Zielgenanreicherung
Manfred Konrada, Sony DADC Austria AG, Salzburg
Blitzlicht Automation
22 Automation der Zielgenanreicherung für den GS FLX
Darren Birr, 454 Life Science, Branford, USA
Expertenpanel Diagnostik
24 Sequenzierungs-basierte Diagnostik
Kerstin Stangier, Dr. Saskia Biskup, Daniela Steinberger, Hanns-Georg Klein
Paperwelt Highlight des Monats
26 Chromothripsis – wenn das Genom explodiert
Jan Korbel, EMBL, Heidelberg
Zellbiologie
III
Wissenschaft Einzelzell-Analyse
6 RGB marking: Klonale Analyse von Krebszellen
Boris Fehse et al., Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf
Expertenpanel Imaging
9 Krebs sehen während der Operation
Dr. Werner Scheuer, Roche Pharma, Penzberg;
Prof. Dr. Go van Dam, Universitätsklinik Groningen, Niederlande
Paperwelt Highlight des Monats
10 DNA-Methylierung als Marker für die Chemotherapie-Resistenz
Matthias Ebert, Universität Heidelberg
Blitzlicht Mikrofluidik
12 Isolierung zirkulierender Tumorzellen
Markus Gusenbauer und Thomas Schrefl,
Fachhochschule St. Pölten, Österreich
Blitzlicht Proteomics
14 Validierung neuer Protein-Biomarker im Kampf
gegen Prostatakrebs
Ralf Schiess et al., Proteomedix AG, Schlieren, Schweiz
Zellbiologie
Spätestens seit EU-Politiker das
Thema Tierversuche entdeckt haben,
wird immer mehr Geld in zellbasierte
Toxizitätstests investiert. Was die
Tests können und nicht können,
diskutieren Thomas Hartung, Jürgen
Hescheler und Dirk Dressler im
Expertenpanel auf Seite 35.
Blitzlicht Zellkultur
28 Schneller Erregernachweis mit Nanomembranen
Bret Barnhizer, Nanologix Inc, Hubbard, USA
Blitzlicht Durchflusszytometrie
30 ReadyFlow – lange Leuchtdauern für Flow Cytometry-Analysen
Dr. Martin Gründkemeyer et al., Technologieförderung Münster GmbH
Paperwelt Impfstoffe
32 Ein Baukasten für Impfstoffverstärker
Carlos Guzman, Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung, Braunschweig
DNA Enrichment
II
Zielgen-Anreicherung
Bis auf das PacBio RS-System sind
alle Next-Generation-Sequenzer auf
einen PCR-Schritt vor der eigentlichen
Sequenzierungsarbeit angewiesen,
der Zielsequenzen anreichert. Eine
mit dem GS FLX kompatible Plattform
hat jetzt die Firma Hamilton Robotics
vorgestellt (S. 22).
Blitzlicht Imaging
33 Zellteilungsdauer im High-Content-Screening bestimmen
Andreas Pippow et al., Fraunhofer FIT, St. Augustin; Bayer Healthcare, Berlin
37 Stellenmarkt Aktuelle Jobangebote
38 Verbände Kontakt zu den LABORWELT-Partnerverbänden
39 Produktwelt Neu auf dem Labormarkt
41 Termine Aktuelle Ankündigungen
42 Ausblick/Impressum
LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 3

Nachrichten Aktuelles
Forschung
Den Pesterreger einfrieren
Braunschweiger Forscher haben eine
trickreiche Strategie zur Bekämpfung der Pest
entwickelt. Angriffspunkt des Teams um Katja
Böhme vom Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung
in Braunschweig ist ein Regulatorprotein,
das den Erreger bei Temperaturen
unter 37°C ruhen lässt. Inaktivierten sie das
molekulare Thermometer durch genetische
Manipulation, konnte ein naher Verwandter
des Pesterregers – das Durchfallbakterium
Yersinia pseudotuberculosis – nicht mehr sein
krankmachendes Programm im menschlichen
Körper starten. Dieses wird durch das
Schlüsselprotein LcrF aktiviert. Damit LcrF
das bakterielle Verteidigungsprogramm
scharfstellen kann, muss jedoch erst der
Transkriptionsrepressor YmoA von der DNA
gelöst werden. Dies geschieht in intakten
Krankheitserregern, sobald sie in den Körper
gelangen und die Temperatur auf 37 °C steigt.
Auch die LcrF-mRNA kann nur bei Körpertemperatur
abgelesen werden; vorher bildet sie
ein nicht ablesbares Knäuel. „Wir konnten die
Temperaturkontrolle von LcrF gleich auf zwei
Ebenen beeinflussen“, so Böhme. „Zunächst
haben wir die Menge von YmoA künstlich
gesteigert und so das Gen für den Regulator
LcrF inaktiviert.“ Zusätzlich tauschten die Forscher
einzelne mRNA-Bausteine aus, so dass
sich YmoA auch bei Körpertemperatur nicht
mehr in seine Funktionsform entfalten konnte.
Daraufhin war das Immunsystem in der Lage,
die Erreger zu beseitigen.
Ihre Forschungsergebnisse sehen die Forscher
als Grundlage für die Entwicklung eines
neuen Medikamentes. „Ein Molekül, das die
mRNA von LcrF wie eine Klammer zusammenhält,
würde die Yersinien inaktivieren
und sie so dem Immunsystem ausliefern“, so
Abteilungsleiterin Petra Dersch. Außerdem
würde ein solcher Wirkstoff ausschließlich die
krankmachenden Yersinien treffen, da nur sie
dieses molekulare Thermometer besitzen.
Kommunikation
Nachhilfe in
Medienkompetenz
Keine Geheimbünde, kein Elfenbeinturm
und kein Fachkauderwelsch – Wissenschaftler
sollen ihre gewonnenen Erkenntnisse publik
machen. Ein neugegründetes Institut wird den
gewillten Forschern künftig beibringen, wie
man gut mit der Öffentlichkeit kommuniziert:
Wie Ende Februar bekannt wurde, soll das von
der Klaus-Tschira-Stiftung gegründete Nationale
Institut für Wissenschaftkommunikation
(NaWik) im Oktober 2012 mit dem Lehrbetrieb
beginnen. Es ist am Karlsruher Institut
für Technologie (KIT) angesiedelt und wird
zunächst für fünf Jahre mit insgesamt bis zu
10 Mio. Euro gefördert. Das NaWik kooperiert
mit der Nature Publishing Group, zu der unter
anderem auch Spektrum der Wissenschaft,
Nature und Scientific American gehört.
Zunächst ist geplant, Module zu entwickeln,
die in die naturwissenschaftliche Ausbildung
von Doktoranden und Master-Studenten am
KIT integriert werden. Später sollen dann die
besten Modelle deutschlandweit an Universitäten
und Forschungsinstituten angeboten
sowie Weiterbildungsmöglichkeiten auch
für Postdocs und Gruppenleiter geschaffen
werden.
Forschung
Leuchtturm für
die Hauptstadt
Ende Februar fiel die Grundsatzentscheidung:
Teile des Max-Delbrück-Centrums für
Molekulare Medizin und der Charité Universitätsmedizin
Berlin werden zusammengeführt.
Die Erwartungen, die Bundesforschungsministerin
Annette Schavan an das neue Berlin
Institute of Health stellt, sind groß: „Mit diesem
Projekt können wir eine Einrichtung von
Weltrang für die Gesundheitsforschung schaffen“
– und zwar in Sachen Spitzenforschung,
wie auch die Nachwuchsförderung.
Die Entscheidung hat Signalwirkung für
ganz Deutschland. Wenn mit der Exzellenzinitiative
2017 bedeutende Geldmittel vom
Bund wegfallen, dürfte an einigen Unis der
Ruf nach alternativen Finanzierungskonzepten
laut werden. Einrichtungen wie das
Karlsruhe Institute of Technology (KIT) oder
das Berlin Institute of Health könnten dann
als Vorbild dienen.
Von 2013 an sollen die beiden Einrichtungen
verstärkt miteinander kooperieren, in
einer zweiten Phase soll dann die strukturelle
Weiterentwicklung hin zum Berlin Institute of
Health erfolgen. Ob und wieviel Geld es dafür
gibt, wurde indes nicht bekannt.
Brennstoffzelle
Biostrom aus der Stratosphäre
Biologen der Universität Newcastle haben
aus einer Flusswasserprobe sieben exoelektrogene
Bakterien isoliert und zur Stromproduktion
in einer mikrobiellen Brennstoffzelle eingesetzt.
Die Ergebnisse des Teams um Jinwei Zhang
und Grant Burgess wurden in Environmental
Science and Technology veröffentlicht. Ließen
die Briten die Mikroben als Biofilm auf den
Kohlenstoffeletroden wachsen, produzierten
sie soviel Strom, dass eine Lampe aufleuchtete.
Als besonders effektiv erwiesen sich dabei zwei
„Außerirdische“, auf die die Wissenschaftler
überraschenderweise in ihrer Probe gestoßen
waren: Bacillus stratosphericus und Bacillus
altitudinis kommen in den oberen Schichten
der Atmosphäre vor.
In den mikrobiellen Brennstoffzellen (microbial
fuel cells, MFC) der Forscher besiedeln die
exoelektrogenen Mikroorganismen als Biofilm
die Kohlenstoffelektroden. Über den Prozess
der katalytischen Oxidation setzen sie dort
organische Verbindungen in Elektrizität um.
Jinwei und Burgess fanden heraus, dass auch
die Zusammensetzung des Biofilms Einfluss
auf die Stromproduktion hat: Biofilme aus
einer einzigen Art waren denen aus mehreren
Arten unterlegen. Mit einem Mix aus den 25
besten (bereits bekannten und neu entdeckten)
exoelektrogenen Bakterienarten erreichten
die Forscher eine Leistung von 200 mW pro
Quadratmeter.
Allerdings ist der Weg von der Labor-MCF
zur Stromproduktion noch weit. Vom Labormaßstab
bis in die großtechnische Produktion
veranschlagen Experten rund 10 bis 20 Jahre.
4 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT

Aktuelles Nachrichten
Forschung
Echtzeit-Imaging verrät Tumorgewebe
Irische Forscher haben ein neues Verfahren
entwickelt, mit dessen Hilfe man in Echtzeit
genau beobachten kann, wo sich im Körper
Tumorgewebe befindet. Ziel der Gruppe um
Erstautorin Michelle Cronin vom Universitäts-
College Cork (UCC) ist es, Bakterien zur Bekämpfung
von Krebs einzusetzen. Weil die Mikroben
sich mit Vorliebe in Tumorgewebe aufhalten,
versprechen sie ein exaktes Tumortargeting.
Um das Fernziel zu erreichen, mussten die
Mikrobiologen jedoch zuerst sicherstellen,
dass die Bakterien das Krebsgewebe verlässlich
erkennen und besiedeln. Ende Januar
gelang der Nachweis: die Iren präsentierten
ein Bildgebungsverfahren, mit dem sie den
Weg der Bakterien dreidimensional in vivo verfolgen
können. Dazu injizierten sie mit einem
Biolumineszenz-Gen ausgestattete Bakterien
ins Blut von Mäusen. Dank neuer optischer 3D-
Tomographen konnten sie den Aufenthaltsort
und die Anzahl der leuchtenden Einzeller so
genau wie nie zuvor bestimmen.
Bereits seit 15 Jahren wird am Tumortargeting
mit Bakterien geforscht – am intensivsten
an Salmonella typhimurium. Erste klinische
Studien mit Salmonellen ergaben indes, dass
der therapeutische Nutzen die Gefahr, eine
Immunantwort oder Krankheiten auszulösen,
nicht aufwiegt. Die irischen Onkologen testeten
daher auch nicht-pathogene Bakterien. Das
Fazit der Forscher: Sie finden Krebs ebenso
effektiv wie Salmonellen. Diese wollen die Iren
nutzen, um Chemotherapeutika gezielt in den
Tumor zu schleusen.
Genetik
Evolution:
DNA springt mit
Wiener Tiermediziner haben bei der Taufliege
Drosophila malanogaster erstmals alle
springenden Gene und deren Einbauorte
komplett kartographiert. Die Transposons beeinflussen
die Evolution offenbar viel stärker
als gedacht, so das Fazit der Wiener Forschergruppe
um Christian Schlötterer. Nach Durchzählen
aller mobilen DNA-Elemente in einer
Drosophila-Population mit einem eigens für
diesen Zweck entwickelten Verfahren stellten
die Forscher überraschenderweise fest, dass
es im Genom viel mehr Stellen gibt, in die
die Transposons potentiell springen können,
als bisher gedacht (PLoS Genetics (2012):
8(1):e1002487.). An insgesamt 13 Einbaustellen
– bisher waren nur zwei bekannt – fanden
die Forscher stabil eingebaute springende
Gene, die sich sich offenbar positiv auf die
Tiere auswirken. Für Schlötterer ein Beweis
für die Bedeutung der Transposons in der
Evolution: „Wir sollten sie überhaupt nicht als
Parasiten sehen. Sie gehören möglicherweise
zu den Mechanismen, mit denen Organismen
ihr genetisches Repertoire vergrößern, um
besser auf zukünftige Herausforderungen
vorbereitet zu sein.“
Mikrobiologie
Forscher bauen Hefe-Magneten
Forscher der Universität Harvard (Boston,
USA) haben Hefezellen magnetisch gemacht.
Dafür bedarf es nur überraschend weniger
molekularer Tricks: Wie sie im Fachmagazin
PLoS Biology berichten, orientiert sich die
aufgerüstete Bäckerhefe in der Petrischale
entlang magnetischer Feldlinien.
Um Saccharomyces cerevisiae den Sinn
für Magnetismus einzuimpfen, mussten die
Forscher um Pamela Silver und Keiji Nishida
zunächst das Gen für ein Eisentransportprotein
zerstören, das das Eisen in die Vakuolen der
Zelle entsorgt. Da das so im Zytosol angereicherte
Eisen auch toxisch wirken kann, ließen
die Forscher die Hefen daraufhin das menschliche
Eisenspeicherprotein Ferritin herstellen.
Ferritin umhüllt die Eisenionen. Damit kann
eine größere Menge Eisen in der Zelle toleriert
werden. Diese beiden Veränderungen reichten
schon aus, um die Zelle für einen Magneten zu
sensibilisieren. Doch Nishida und Silver war das
nicht genug: Sie identifizierten ein Hefe-Gen,
das die magnetische Sensibilität beeinflusst.
Nachdem sie Extrakopien dieses Gens in die
Hefezellen eingeschleust hatten, wurden die
Zellen nochmals magnetischer.
Neben dem wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn
versprechen magnetisch gemachte
Zellen eine Reihe künftiger Anwendungen: die
gezielte Verabreichung von Medikamenten, die
Aufreinigung von Zellpopulationen oder die
Detektion von Krebszellen. Allerdings sei es bis
zu möglichen Anwendungen laut den Forschern
noch ein weiter Weg.
Mit Magneten in Form gebrachte Hefezellen
Paläogenomik
Auf den Spuren
der Ur-Menschen
Vor zwei Jahren überraschten die Leipziger
Paläogenetiker um Svante Pääbo vom Max-
Planck-Institut für Evolutionäre Anthropologie
mit der Entdeckung einer neuen fossilen
Menschenform. Jetzt haben sie im Internet
die komplette DNA-Sequenz des Genoms des
Denissova-Menschens in 30-facher Abdeckung
offengelegt.
In der Denissova-Höhle im Altai-Gebirge
fanden russische Forscher 2008 das Fragment
eines Fingerknochens. Die Analyse der daraus
extrahierten DNA in Leipzig ergab, dass es
sich weder um einen modernen Menschen
(Homo sapiens) noch um einen Neanderthaler
(Homo neanderthalensis) handelte. Der „Homo
denisova“ war entdeckt. Er gilt als einer der
Vorfahren polynesischer und australischer
Ureinwohner.
2010 wurde die vorläufige Sequenz des
Denissova-Genoms mit 2-facher Coverage veröffentlicht.
Die Wissenschaftler hoffen, dass
mit den neuen, viel genaueren Daten , die auch
repetitive genomische Bereiche gut abdecken,
genetische Veränderungen aufgespürt werden
können, die für die Entwicklung des modernen
Menschen wichtig waren.
LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 5

Krebszellanalyse Einzelzell-Analyse
I Krebszellanalyse RGB marking :
Vielfarbige Zellmarkierung
zur klonalen Analyse
Dr. Kristoffer Weber, Michael Thomaschewski, Michael Warlich, Dr. Kerstin Cornils,
PD Dr. Daniel Benten, Prof. Dr. Boris Fehse; Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf
Biomarker sind ein Hauptprodukt der 7.000
Publikationen über Krebs, die jeden Tag erscheinen,
und von Großprojekten wie dem
internationalen Krebsgenom-Projekt. Die
Kunst besteht darin, aus der Fülle Kandidatengene,
-RNAs, Proteine und Metabolite
die biologisch relevanten herauszufiltern
und auf dieser Basis Frühererkennungstests
zu entwickeln. Denn noch immer gilt: je
früher der Krebs erkannt wird, desto besser
die Aussichten für den Patienten.
Biomarker gesucht
Über einen DNA-Methylierungsmarker,
der anzeigt, ob Darmkrebspatienten auf
eine Chemotherapie ansprechen, berichtet
hier eine Gruppe um Matthias Ebert
(Paper of the month). Die Forscher haben
per DNA-Sequenzierung nicht nur den
Transkriptionsfaktor, sondern auch den
betroffenen Signalweg ausgemacht, der
die Therapieresistenz bedingt. Mittels
massenspektrometrischer Proteomanalyse
haben dagegen Forscher der Universitätsausgründung
Proteomedix vier Biomarker-
Proteine identifiziert, die die Spezifität der
Prostatakrebsdiagnose um mehr als 40%
verbessert. Ihren Test sieht die Gruppe
um Dr. Ralph Schiess als Ergänzung zum
PSA-Test. Noch im Forschungsstadium
ist dagegen eine von Thomas Schrefl und
Kollegen (Technische Hochschule St. Pölten,
Österreich) entwickelte Simulationssoftware,
die die Optimierung mikrofluidischer
Chips ermöglichen soll, die wie ein Molekularsieb
zirkulierende Tumorzellen aus dem
Blut filtern und so eine Früherkennung der
Metastasierung erkennen.
Über eine Technik, die es erstmals gestattet,
die Entwicklung einzelner Tumorstammzellzellen
zu verfolgen, hat jetzt
ein Team vom Universitätskrankenhaus
Hamburg-Eppendorf entwickelt. Zwar ist
der methodische Fortschritt bei der Analyse
von Krebs und Tumoren langsam. Die Integration
der Daten über Biomarker verspricht
für die Zukunft aber ein besseres Verständnis
dieses komplexen Krankheitsbildes.
Lentivirale Vektoren integrieren in das Zielzellgenom und erlauben so die permanente Markierung
genetisch modifizierter Zellen und ihrer Nachkommen. Kodieren die eingebrachten Vektoren für
Fluoreszenzproteine, lassen sich markierte Zellen anhand der emittierten Fluoreszenz im Mikroskop
oder mit Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) identifizieren. Wir konnten kürzlich
zeigen, dass die simultane lentivirale Expression dreier Fluoreszenzproteine (Rot, Grün, Blau = RGB
marking) im Einklang mit dem additiven Farbmodell zur Generierung spezifischer Mischfarben
führt, welche an die Tochterzellen vererbt und so zu einer klonalen Eigenschaft werden. Darauf
aufbauend eignet sich das RGB marking mit lentiviralen LeGO-Vektoren für die Verfolgung von
Zellklonen sowohl im Rahmen der normalen Regeneration als auch der Kanzerogenese.
Von Retroviren abgeleitete Vektoren haben sich
als vielseitige Werkzeuge für die zellbiologische
Forschung und die Gentherapie erwiesen. Ihre
stabile Integration in das Zielzellgenom erlaubt
die in vitro- und in vivo-Untersuchung langfristiger
Effekte der Expression eingebrachter
Transgene 1 . Auch für viele Anwendungen in der
Gentherapie ist eine stabile Langzeitexpression
des eingebrachten, therapeutischen Gens essentiell
2 . Umgekehrt können retrovirale Vektoren
auch benutzt werden, um interessierende Gene
über lange Zeiträume mit Hilfe der RNA-Interferenz
abzuschalten oder herunterzuregulieren 3 .
Allerdings ist die weitgehend ungerichtete
Integration retroviraler Vektoren in das Zielzellgenom
mit dem Risiko der unbeabsichtigten
Aktivierung oder Zerstörung betroffener Genloci
durch Insertionsmutagenese verbunden, welche
im ungünstigsten Fall zur malignen Transformation
der Zelle führen kann 4 .
Um das Risiko der Insertionsmutagenese zu
minimieren, wurde die Architektur retroviraler
Vektoren dahingehend optimiert, dass die starken
viralen Promotoren und Enhancer aus den
long terminal repeats (LTRs) entfernt wurden.
Die Entwicklung solcher selbst-inaktivierenden
(SIN-)Vektoren mit nicht-viralen Promotoren
hat zu einer signifikanten Verringerung des
Risikos der Insertionsmutagenese im Tiermodell
geführt 5,6 .
LeGO-Vektoren und Fluoreszenzproteine
zur Zellmarkierung
Eine weitere Möglichkeit der Risikoverringerung
ist die Entwicklung von Vektoren auf Basis von
Retroviren, die ein anderes Integrationsmuster
aufweisen. So hat sich gezeigt, dass die als
Ausgangsbasis für retrovirale Vektoren der
ersten Generation benutzten γ-Retroviren
vom MLV-Typ (MLV = Murines Leukämievirus)
eine Tendenz zur verstärkten Integration in
Promotor- und Enhancerregionen von Genen
aufweisen, die als besonders anfällig für die
Insertionsmutagenese gelten 7 . Dagegen integrieren
vom Humanen Immundefizienzvirus
(HIV) abgeleitete, lentivirale Vektoren 1 bevorzugt
in transkribierte Sequenzbereiche außerhalb
der Promotor- und Enhancerregionen 8 . Andere,
wie die α-Retroviren, scheinen sogar ein völlig
neutrales Integrationsbild zu zeigen, was sie zu
vielversprechenden Kandidaten für die Vektorentwicklung
macht 9 .
Lentivirale (SIN-) Vektoren werden aufgrund
ihrer sehr hohen Effizienz in den unterschiedlichsten
Zellsystemen und des angesprochenen
geringeren Risikos einer Insertionsmutagenese
derzeit in vielen Labors für die Transgenese
benutzt. Wir haben kürzlich ein modulares
Vektorsystem entwickelt, welches dem
Baukastenprinzip folgt. Diese „lentiviralen
Gen-Ontologie“(LeGO)-Vektoren erlauben die
permanente Überexpression sowie die Herunterregulation
von zu untersuchenden Genen 10, 11 .
Eine weitere, sehr interessante Anwendung der
LeGO-Vektoren ist die permanente Zellmarkierung.
Die Markierung und die damit verbundene
Wiedererkennbarkeit von Zellen und deren
Tochterzellen hat wesentlich zu einem besseren
Verständnis normaler Regenerationsprozesse
sowie der Entstehung und Entwicklung maligner
Krankheiten beigetragen 12 . Einen dauerhaften
Entwicklungsschub für Markierungsansätze
brachte in diesem Kontext die 2008 mit dem Nobelpreis
für Chemie ausgezeichnete Entdeckung
fluoreszierender Proteine und ihre Entwicklung
als Markergene 13, 14 . Allerdings ist trotz einer
Vielzahl neu beschriebener Fluoreszenzproteine
die Zahl unterschiedlicher und tatsächlich
unterscheidbarer Marker auf eine Handvoll beschränkt
15 . Praktisch bedeutet dies zum Beispiel,
6 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT

Einzelzell-Analyse Krebszellanalyse
Abb. 1: (a) Nach dem additiven Farbmodell entstehen durch die Mischung der drei Grundfarben
Rot, Grün und Blau die drei Farben Gelb, Cyan und Magenta sowie Weiß, wenn alle
drei Grundfarben überlagern. (b) Erfolgt die Mischung stufenlos, können theoretisch
unendlich viele Farbtöne generiert werden. (c) Drei lentivirale Vektoren, die jeweils ein
Fluoreszenzprotein in einer der drei Grundfarben exprimieren, werden gleichzeitig zur
Transduktion von Zellen in vitro verwendet. Je nachdem, durch welche Vektoren eine
Zelle transduziert wurde, wird sie verschiedene Kombinationen der Fluoreszenzproteine
exprimieren. (d) RGB-markierte Zelllinien HEK-293T, BON und FH-hTERT. Durch die
klonale Markierung der Zellen ist das unterschiedliche Wachstumsverhalten der verschiedenen
Zelllinien in vitro erkennbar. [Modifiziert, nach Nat. Med. 17 (2011), 504-509]
dass auf der Basis einer permanenten Zellmarkierung
mit den vorhandenen Fluoreszenzproteinen
zwar die Organregeneration als ganzes,
nicht jedoch der tatsächliche Beitrag einzelner
Zellklone visuell nachvollziehbar ist 16 .
Genau der Beitrag distinkter Zellklone zur
normalen Gewebsregeneration und zur überschießenden
Regeneration und dem Auswachsen
maligner Tumoren war es, der uns interessierte
– vor allem im Rahmen eines Projektes des
SFB841 „Leberentzündung: Infektion, Immunregulation
und Konsequenzen“. Daher standen wir
vor der Aufgabe, mit der vorhandenen, begrenzten
Zahl unterscheidbarer Fluoreszenzproteine
eine möglichst unbegrenzte Zahl unterschiedlicher
Zellklone definitiv identifizierbar zu
machen. Eine Lösung dieses Paradoxons ergab
sich aus der additiven Farbenlehre. Danach lässt
sich in einem dreidimensionalen Farbraum aus
den drei Grundfarben (Rot, Grün und Blau, RGB)
jede beliebige Mischfarbe generieren (Abb. 1a,
b). Dieses Verfahren der Farbmischung aus den
Grundfarben wird zum Beispiel auch in Fernsehern
und Computerbildschirmen verwendet.
Die Frage war, ob sich das RGB­Prinzip auch auf
die LeGO­Vektor vermittelte Expression dreier
Fluoreszenzproteine in lebenden Zellen anwenden
lässt (Abb. 1c).
Um dies zu testen, benutzten wir drei LeGO­
Vektoren, die für jeweils ein Fluoreszenzprotein
kodierten: LeGO­C2 für mCherry (Rot), LeGO­V2
für Venus (Gelbgrün) und LeGO­Cer2 für Cerulean
(Blau). Die Transduktion der Zielzellen
erfolgte gleichzeitig mit allen drei Vektoren
mit zuvor berechneten identischen Mengen
infektiöser Partikel (sog. MOI = Multiplizität der
Infektion). Die MOI war dabei so eingestellt, dass
mit jedem einzelnen der drei Vektoren ca. 50%
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Krebszellanalyse Einzelzell-Analyse
Abb. 2: (a) Zahlreiche RGB-markierte Lebertumoren sind nach der Transplantation RGBmarkierter
BON-Zellen im Leberschnitt sichtbar. Die meisten Tumoren sind einfarbig,
einige mehrfarbig. (b) Einfarbige Tumoren wurden explantiert und in vitro kultiviert.
(c) Sekundäre Tumoren nach Retransplantation der Zellen aus den primären Tumoren.
Alle sekundären Tumoren sind einfarbig. (d) Sekundäre Tumoren nach Retransplantation
gemischter Zellen beider primärer Tumoren. Hier sind sowohl einfarbige
als auch gemischte, zweifarbige Tumoren sichtbar. (e) Molekulare Analyse der sekundären
Tumoren (aus c und d) durch Insertionsstellen-spezifische PCR, zum Nachweis
der klonalen Identität. [Modifiziert, nach Nat. Med. 17 (2011), 504-509].
aller Zellen transduziert wurden. Somit waren
aus kombinatorischer Sicht acht verschiedene
Gruppen transduzierter Zellen zu erwarten,
die jeweils 12,5% aller Zellen umfassen sollten
(Tab. 1) 17 . Vier dieser Gruppen waren durch die
Expression mindestens zweier unterschiedlicher
Fluoreszenzproteine charakterisiert und ließen
mithin die für das RGB marking notwendige
Entstehung von Mischfarben erwarten (Tab. 1).
Eine grundlegende Voraussetzung für die Vielfalt
der generierten Mischfarben bestand darin, dass
die zu mischenden Grundfarben in unterschiedlichen
Intensitäten vorliegen. Beim RGB marking
mit LeGO-Vektoren sollte dies durch zwei wichtige
Parameter des Gentransfers gewährleistet
werden: Erstens, kann bei Gentransferraten von
mehr als 50% pro Vektor davon ausgegangen
werden, dass in einzelnen Zellen die Zahl der
Vektorinsertionen für jede Farbe zwischen
eins und drei variiert 18, 19 . Zweitens ist bekannt,
Tab. 1: Bei einer Transduktionsrate von 50%
je Farbe, sind die dargestellten Gruppengrößen
zu erwarten.
Vektoren pro Zelle Gruppengröße
rot 12,5 %
grün 12,5 %
blau 12,5 %
rot + grün 12,5 %
rot + blau 12,5 %
grün + blau 12,5 %
rot + grün + blau 12,5 %
nicht transduziert 12,5 %
dass die Integrationsstelle eines Vektors einen
signifikanten Einfluss auf die Expression des
eingebrachten Transgens hat 19 .Die entscheidende
Frage war, ob diese beiden Parameter
zusammengenommen nicht nur hochspezifisch
für eine gegebene Zelle sind, sondern auch an
alle Tochterzellen weitergegeben werden und
somit einen klonalen Marker darstellen.
Wie erste Analysen in vitro mit HEK293T-
Zellen zeigten, erlaubte das RGB marking
tatsächlich die Identifikation von Zellklonen
anhand der spezifischen Farbe, die allen Zellen
des Klons gemein war (Abb. 1d) 17 . Dabei werden
die verschiedenen Zellklone anhand ihrer individuellen
Farbe im Fluoreszenzmikroskop direkt
sichtbar gemacht, ohne dass die Zellintegrität
zerstört werden muss (Abb. 1d). Damit ist eine
Klonalitätsanalyse in sehr kurzer Zeit möglich.
Im nächsten Schritt war die für die Anwendbarkeit
des RGB marking entscheidende
Frage der Farbkonstanz in vivo zu klären.
Eines der von uns dazu benutzten Modelle
basierte auf der seriellen Transplantation von
RGB-markierten karzinogenen BON-Zellen.
Wie erwartet hatten die RGB-markierten
BON-Zellen in primären Rezipienten Lebertumoren
gebildet, die in der Mehrzahl aus Zellen
ein- und derselben Farbe bestanden (Abb. 2a) 17 .
Allerdings waren auch einige „Mischtumoren“
nachweisbar (Abb. 2a) 17 . Wir explantierten einige
der monochromen Tumoren, vereinzelten
die Zellen und nahmen diese in Kultur. Wie wir
zeigen konnten, wiesen alle aus einem Tumor
isolierten Zellen über den gesamten Beobachtungszeitraum
hinweg dieselbe Farbe wie der
Ursprungstumor auf (Abb. 2b) 17 . Wurden diese
Zellen in sekundäre Rezipienten transplantiert,
entstanden erneut Tumoren, die durch die
gleiche RGB-Farbe wie der Ausgangstumor
charakterisiert waren (Abb. 2c) 17 . Mischten wir
für die Transplantation RGB-markierte Zellen,
die von zwei unterschiedlichen Tumoren
abstammten, entstanden in den Sekundärrezipienten
sowohl monochrome Tumoren, die
den beiden Ausgangstumoren entsprachen,
als auch zweifarbige Tumoren, die aus Zellen
beider Ausgangstumoren bestanden (Abb.
2d) 17 . Folglich haben nicht die Zellen innerhalb
eines Tumors in vivo ihre Farbe geändert, sondern
mehrfarbige Tumoren sind aus mehreren
Zellen verschiedener Farbe entstanden. Mit
diesen sowie damit einhergehenden molekularbiologischen
Untersuchungen (Abb. 2e)
konnten wir nachweisen, dass das RGB marking
eine klonale, langfristige und eindeutige
Zellmarkierung in vivo ermöglicht 17 .
Insgesamt ist es uns gelungen, mit dem RGB
marking eine neue Methode der klonalen Zellmarkierung
zu entwickeln, die für unterschiedlichste
Anwendungen sowohl in Modellen der
regenerativen Medizin als auch der Kanzerogenese
von großem Interesse sein dürfte.
Literatur
[1] Naldini, L. et al., Science 272 (1996), 263-267
[2] Alexander, B.L. et al., Gene Ther. 14 (2007),1439-1447
[3] Singer, O., Verma, I.M., Curr Gene Ther. 8 (2008), 483-488
[4] Baum, C. et al., Hum Gene Ther. 17 (2006), 253-263
[5] Cornils, K. et al., Mol Ther. 17 (2009), 131-143
[6] Zychlinski, D. et al., Mol Ther. 16 (2008), 718-725
[7] Wu, X. et al., Science 300 (2003),1749-1751
[8] Wang, G.P. et al., Genome Res. 17 (2007), 1186-1194
[9] Suerth, J.D. et al., J Virol. 84 (2010), 6626-6635
[10] Weber, K. et al., Mol Ther. 16 (2008), 698-706
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[12] Barese, C.N., Dunbar, C.E., Hum Gene Ther. 22 (2011),
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[18] Fehse, B. et al., Gene Ther. 11 (2004), 879-881
[19] Kustikova, O.S. et al., Blood 102 (2003), 3934-9397
Wir möchten uns bei vielen Kollegen bedanken, die uns mit
Zellen und Konstrukten unterstützt haben: H. Wege (Universitätsklinikum
Hamburg-Eppendorf) für FH-hTERT Zellen, R.Y.
Tsien (Howard Hughes Medical Institute) mCherry cDNA, A.
Miyawaki (RIKEN) und T. Schroeder (Institute for Stem Cell Research)
Venus cDNA und D.W. Piston (Vanderbilt-Ingram Cancer
Center) für Cerulean cDNA. Durchflusszytometrie wurde in der
FACS Sorting Core Unit des Universitätsklinikums Hamburg-
Eppendorf durchgeführt. Konfokale Mikroskopie wurde mit
Hilfe von O. Bruns (Heinrich-Pette-Institut Hamburg) in Zusammenarbeit
mit dem Nikon Application Center Norddeutschland
durchgeführt. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Deutsche
Forschungsgemeinschaft (SFB841 an B.F. und D.B.) und
die Nachwuchsförderung des Forschungsförderungsfonds der
Medizinischen Fakultät Hamburg (NWF-12/09 an K.W.).
Korrespondenzadresse
Prof. Dr. Boris Fehse
Forschungsabteilung Zell- und Gentherapie
Klinik für Stammzelltransplantation
Onkologisches Zentrum – UCCH
UK Hamburg-Eppendorf
Martinistr. 52, 20246 Hamburg
Tel./Fax: +49-40-7410-55518/-55468
8 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT

Expertenpanel Krebszellanalyse
Real-time Tumor-Imaging
Bereits seit 60 Jahren träumen Krebschirurgen davon, Tumore spezifisch anzufärben und
diese dann während der Operation besser sichtbar machen zu können. Denn ein verbessertes
Erkennen und Entfernen des Tumorgewebes verspricht bessere Aussichten für die Patienten.
Bisherige krebsspezifische Farbstoffe blieben indes meist im Tierversuchsstadium, weil ihre
Eigenschaften nicht ohne weiteres auf den Menschen übertragen werden können und daher die
Kosten klinischer Studien von mehr als 1 Mio. Euro als zu risikoreich galten. Zusätzlich erfassten
Fluoreszenzkameras nicht nur die Fluoreszenz, die von den markierten Zellen ausging, sondern
auch die Eigenfluoreszenz, Reflexion, Streuung etc. Angesichts der Zulassung der ersten klinischen
Studien zum intraoperativen Tumor-Imaging befragte LABORWELT einen Farbstoff- und
einen Kamera-Experten, was sich geändert hat und wohin die Entwicklung geht.
Werner Scheuer
Dr. Werner Scheuer,
ist Forschungsleiter
in der Abteilung
pRED, Discovery
Oncology, bei Roche
Diagnostics GmbH
in Penzberg.
LABORWELT
Welche Methoden gibt es, Tumorzellen spezifisch
zur Fluoreszenz anzuregen, und wo liegen
ihre jeweiligen Stärken und Schwächen
Scheuer
Die beste Methode, um spezifisch Tumorzellen
zu identifizieren, ist der gezielte Einsatz von
mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten
Antikörpern, die gegen ein Tumor-assoziiertes
Zelloberflächen-Antigen gerichtet sind. Entsprechende
Antikörper-Fluorophor-Konstrukte
bilden die Grundlage des FACS-Verfahrens, das
bereits seit Jahren eingesetzt wird, um Tumorzellen
ex situ zu identifizieren. Zusätzlich werden
diese Antikörper zur immunhistochemischen
Untersuchung von Krebs in Gewebebiopsien
eingesetzt. Das „Krebsantigen“ sollte dabei
funktionell am Wachstum des Primärtumors
beteiligt sein und mit dem Schweregrad der
Erkrankung korrelieren. Sogenannte Quantum
dots weisen zwar exzellente (Fluoreszenz-)
Eigenschaften auf, aber sie können sich in der
Leber anreichern oder von Makrophagen aufgenommen
werden und sind oft toxisch. Auch
wurden Antikörper eingesetzt, die mit radioaktiven
Isotopen markiert waren. Diese zeigten
aber Nachteile wie eine geringe Auflösung und
eine kurze Lebensdauer beziehungsweise Halbwertszeit.
Um für den intraoperativen Einsatz
geeignet zu sein, muss ein krebsspezifischer
Marker besondere Anforderungen erfüllen.
Physikochemisch sind insbesondere eine hohe
Quantenausbeute, eine Emission im fernen
Infrarotbereich, hohe Fluoreszenzstabilität
und Lagerfähigkeit, Nichttoxizität sowie eine
einfache und wirtschaftliche Produktion gefordert.
Das Ankoppeln des Fluoreszenzlabels
an den Antikörper sollte in einer Ein-Schritt-
Reaktion erfolgen und nicht die Bindungskinetik
an das Zielantigen stören. Zahlreiche
Fluorophore müssen zudem optimiert werden,
um Fluoreszenzbleaching zu vermeiden. Das
Fluorophor-Antikörper-Konstrukt muss nach
intravenöser Applikation eine optimale Serumstabilität
aufweisen. Zudem ist seine Sicherheit
in Cynomolgus-Makaken nachzuweisen. All
dies erfüllen zwei an den Fluoreszenzfarbstoff
IRDye800CW gekoppelte neue Antikörperkonstrukte,
von denen einer unlängst die Zulassung
für klinische Tests erhalten hat: der gegen das
teils membrangebundene Antigen VEGF gerichtete
Antikörper Avastin-IRDye800CW wird bereits
ab diesem Herbst klinisch getestet. Danach
sind auch Studien mit einem gegen den Her2/
neu-Rezeptor gerichteten Antikörper Herceptin-
IRDye800CW geplant. Sie sollen mikrodosiert
(Faktor 100 unter minimaler Wirkkonzentration
des therapeutischen Antikörpers) verabreicht
werden. Gegenüber Labeling-Ansätzen, die auf
die Spaltung fluoreszenzgelöschter Peptide
durch Krebszellproteasen setzen, weisen die
zugelassenen Label den Vorteil auf, nicht in die
Zelle aufgenommen und dort möglicherweise
abgebaut zu werden.
Go van Dam
Prof. Dr. Gooitzen van
Dam, Principal Investigator,
Forschungsgruppe
„Intraoperatives
Optisches Imaging“,
Abt. Chirurgie,
Univ. Groningen.
LABORWELT:
Wo liegen die Stärken und Schwächen der derzeitigen
NIR-Fluoreszenz-Kamerasysteme, die
zum intraoperativen Tumorimaging genutzt
werden sollen
van Dam:
Momentan gibt es nur ein einziges tatsächlich
klinisch angewandtes Infrarot-Fluoreszenzkamerasystem,
das Chirurgen in Kombination
mit krebsspezifischen Fluoreszenzfarbstoffen
hilft, zwischen Tumorgewebe und gesundem
Gewebe zu unterscheiden. Es wurde
von Vasilis Ntziachristos entwickelt, der am
Helmholtz-Zentrum München und der Technischen
Universität München forscht, und von
unserer Gruppe im vergangenen Jahr erstmals
an Patientinnen mit Eierstockkrebs getestet.
Alle anderen Imaging-Systeme, die bisher
mit demselben Ziel entwickelt wurden, sind
videographische Systeme. Das Photodynamic
Eye von Hamamatsu Photonics, das Fluobeam-System
von Fluooptics aus Grenoble,
das von der kanadischen Novadaq entwickelte
Spy Imaging System oder das Artemis-System
von O2view haben eines gemeinsam – sie
machen Videos, indem sie lediglich ein Bild
aufnehmen, ohne das physikalische Verhalten
des Lichtes im Gewebe zu berücksichtigen. Sie
korrigieren nicht die Signalabschwächung,
weder durch Streuung oder Absorption noch
durch die Gewebeeigenschaften.
Das waren genau die Herausforderungen,
denen sich Vasilis gegenübersah, als
er 2001/2002 mit der Entwicklung seines
Systems begann: Lediglich eine Epifluoreszenzkamera
zu montieren, war nicht genug.
Denn ein Großteil der Signale ging infolge der
Absorption des Blutes verloren, oder bedingt
durch die Lichtstreuung an Fettgewebe.
Von der physikalischen Seite her, also
der In strumentation, unterscheiden sich
die Kamerasysteme nicht wesentlich. Der
maßgebliche Unterschied besteht in der
Daten akquisition und -analyse. Das Fluoreszenzsignal
wird beim multispektralen
Imagingsystem mit Hilfe eines patentierten
Algorithmus korrigiert, der die Gewebeeigenschaften
berücksichtigt. In Maus-Modellen
konnten wir mit dieser Imagingtechnik die
Rate falsch-positiver und falsch-negativer
Ergebnisse bereits erheblich verringern.
Das aktuelle System erreicht dies durch die
simultane Detektion multipler Wellenlängen,
verbesserte Algorithmen und fortschrittene
Graphic Processing Units (GPU). Eine gut
durch den Chirurgen zu bedienende Software
ermöglicht es, für jeden Patienten und seinen
individuellen Tumor eine Kalibrierung durchzuführen
und anschließend real-time-Bilder
aufzunehmen. Das System schafft damit die
Grundlage dafür, Tumore schon während der
Operation besser zu erkennen, besser zu entfernen
und damit die Prognose der Patienten
maßgeblich zu verbessern. In Pilotstudien im
vergangenen Jahr haben wir bereits zeigen
können, dass das System Eierstocktumore
mit siebenmal höherer Auflösung erkennt
als das menschliche Auge allein. In klinischen
Studien, die in diesem Jahr an der Majo-Klinik
in Rochester beginnen, soll dies an einer
größeren Anzahl von Patienten statistisch
untermauert werden.
www.laborwelt.de
LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 9

Krebszellanalyse Paperwelt
DNA-Methylierung
als Marker für die
Chemotherapie-Resistenz
Matthias P.A. Ebert, Marc Tänzer, M.A., Benjamin Balluff, M.Sc., Elke Burgermeister,
Antje Karen Kretzschmar, David J. Hughes, Reimo Tetzner, Catherine Lofton-Day, Robert
Rosenberg, Anke C. Reinacher-Schick, Karsten Schulmann, Andrea Tannapfel, Ralf
Hofheinz, Christoph Röcken, Gisela Keller, Rupert Langer, Katja Specht, Rainer Porschen,
Jan Stöhlmacher-Williams, Tibor Schuster, Philipp Ströbel, and Roland M. Schmid: TFAP2E-
DKK4 and chemoresistance in colorectal cancer, N Engl J Med. 2012 Jan 5;366(1):44-53
Dass die Inaktivierung von Transkriptionsfaktoren durch DNA-Methylierung einen Hinweis auf
das Ansprechen auf eine Chemotherapie geben könnte, haben Ebert et al in einer retrospektiven
Studie mit initial 78 Patienten mit fortgeschrittenem kolorektalen Karzinom gefunden.
Wurde der Transkriptionsfaktor TFAP2-e infolge einer Hypermethylierung weniger exprimiert,
nahmen zugleich die Expression des DKK4-Gens sowie die Therapieresistenz gegenüber dem
Chemotherapeutikum 5-Fluoruracil (5-FU) zu. In vier weiteren Kohorten mit insgesamt 220
radio- oder chemotherapiebehandelten Patienten ließ sich der Zusammenhang erhärten. Es
zeigte sich ein signifikanter Zusammenhang zwischen der TFAP2-e-Hypermethylierung und
5-FU-Therapieresistenz. Umgekehrt sprachen Patienten mit TFAP2-e-Hypomethylierung mit
sechsfach erhöhter Wahrscheinlichkeit auf die Chemotherapie an. Prospektive Studien und
die Untersuchung der funktionellen Rolle von Dkk4 im Wnt-Signalweg sollen nun helfen zu
klären, ob sich die DNA-Methylierung zur Vorhersage des Therapieansprechens eignet.
LABORWELT:
Was sind Ihre wichtigsten Ergebnisse
Ebert:
Wir konnten mit unserer Arbeit zeigen, dass
das epigenetisch regulierte Gen TFAP2-e in
einer Vielzahl von kolorektalen Karzinomen
methyliert und damit inaktiviert vorliegt.
Wir haben zudem Hinweise gefunden, dass
diese Hypermethylierung Einfluss auf das
Ansprechen dieser Tumore auf eine Chemotherapie
mit 5-Fluoruracil nimmt. Mechanistisch
scheint es die TFAP2-e-Methylierung zu
einer stärkeren Expression des DKK4-Gens
zu führen, das zum Wnt-Signalweg gehört.
Diese Ergebnisse sind retrospektiv erhoben
worden. Deshalb der Konjunktiv. Ich möchte
ich keine falschen Hoffnungen wecken, bevor
die Resultate nicht in einer prospektiven Studie
bestätigt wurden.
LABORWELT:
Wie sind Sie experimentell vorgegangen
Ebert:
Nachdem wir gesehen hatten, dass bei TFAP2-e
bei etwa 50% der Patienten methyliert vorlag,
haben wir uns mit dessen Funktion beschäftigt.
Wir haben festgestellt, dass es keinen besonderen
Einfluss auf Zellwachstum- und -teilung
hat. Aber wenn wir die Zellen mit 5-Fluoruracil
behandelt haben, konnten wir sehen, dass sie
unterschiedlich reagiert haben, je nachdem
ob das TFAP-Gen methyliert vorlag oder nicht.
Wir haben dann einen Screen gemacht, indem
wir das TFAP in Zellen überexprimiert haben
und mittels Microarrays die Auswirkung auf
verschiedene Kandidatengene untersucht haben.
Dabei fiel das DKK4-Gen auf. Aus anderen
Publikationen war von DKK4 bereits bekannt,
dass das Gen möglicherweise eine Rolle bei
der Chemotherapieresistenz spielt. In einem
weiteren Schritt haben wir dann gezeigt, dass
es einen engen Zusammenhang zwischen der
TFAP2-e-Methylierung und der dadurch induzierten
DKK4-Überexpression gibt.
LABORWELT:
Wissen Sie schon, wie häufig der Marker bei
kolorektalem Karzinom und bei anderen
Krebsarten vorkommt
Ebert:
Die Häufigkeit der Methylierung in kolorektalen
Karzinomen liegt nach unseren Ergebnissen
bei etwa 50% . Wir sind dabei, dies auch in
anderen Krebsarten zu untersuchen.
LABORWELT:
Was ist ihr Ziel dabei
Ebert:
Wir beschäftigen uns ja primär mit der Frage,
warum die Chemotherapie bei einem Patienten
wirkt und bei dem anderen nicht. Man
würde gerne bei der Vielzahl von Substanzen,
die zur Verfügung stehen, für jeden Patienten
die ideale Zusammensetzung von Wirkstoffen
Prof. Dr. Matthias Ebert
Prof. Dr. Matthias Ebert Jahrgang 1968, ist
seit 2011 Direktor der II. Medizinischen Klinik
des Universitätsklinikums Mannheim
der Universität Heidelberg. Der gebürtige
Münchener wurde 1995 an der Universität
Ulm promoviert und habilitierte
sich 2002 als Facharzt für Innere Medizin.
Nach Spezialisierung auf das Gebiet
Gastro enterologie erhielt der Heisenberg-
Stipendiat (2002-2004) einen Ruf auf eine
Professur für Klinische und Molekulare
Gastroenterologie an die TU München
(2006). Drei Jahre später wurde er zum Direktor
des Roman-Herzog-Krebszentrums
München bestellt. Eberts wissenschaftliches
Interesse gilt der Pathogenese und
Progression des Magenkarzinoms sowie
der klinischen und translationalen Onkologie,
insbesondere der Biomarkeranalyse.
Der Inhaber mehrerer Patente hat
mehr als 100 wissenschaftliche Arbeiten
veröffentlicht.
finden, auf die dessen Tumor gut anspricht.
Wir und viele andere Gruppen denken, dass
Biomarker dabei hilfreich sein können. Unser
Marker zeigt, dass epigenetisch regulierte
Gene ein möglicher Ansatzpunkt für die Vorhersage
des Therapieansprechens sind. Die
Befunde müssen aber, wie gesagt, durch prospektive
Studie, also an noch nicht behandelten
Patienten, zunächst abgesichert werden. Wir
sind dabei, eine entsprechende Forschungsförderung
zu beantragen. Erst danach werden
wir soweit sein, einen entsprechenden Test zu
etablieren, der die Wahrscheinlichkeit auf 5-FU
anzusprechen, vorhersagt.
LABORWELT:
Wie gehen Ihre Arbeiten jetzt weiter
Ebert:
Wir untersuchen die Rolle der TFAP-Methylierung
auch in anderen Tumoren, und wir
schauen uns auch andere Chemotherapeutika
an. Drittens planen wir mit verschiedenen
Partnern die angesprochene prospektive Studie,
und viertens, wollen wir weiter aufklären,
welche funktionelle Rolle Dkk4 tatsächlich bei
der Chemotherapieresistenz spielt.
10 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT

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Krebszellanalyse Mikrofluidik
Isolierung zirkulierender
Tumorzellen
DI (FH) Markus Gusenbauer, Dr. Thomas Schrefl, Fachhochschule St. Pölten
Die Analyse der Menge zirkulierender Tumorzellen im Blut ermöglicht die Kontrolle des Erfolges
einer Krebstherapie sowie die Überwachung des Tumorwachstums. Doch die Konzentration
der Zellen im Blut ist niedrig, so dass ihre Anreicherung oder Isolierung erforderlich ist.
Mikrofluidik-Chips zur Isolierung zirkulierender Tumorzellen werden in naher Zukunft eine
wichtige Rolle beim Therapiemonitoring von Krebserkrankungen spielen. In miniaturisierten
Fluid-Kanälen bilden magnetische Partikel Ketten, deren Abstand sich durch gezielte magnetische
Quellenfelder manipulieren lässt. Die so entstandene Struktur eignet sich als Filter
zur Isolierung der zirkulierenden Tumorzellen. Der hier vorgeschlagene Chip kombiniert die
mechanische und die biomagnetische Filterung. Mit Hilfe von Computersimulation kann der
Chip entwickelt und optimiert werden.
Im Blut zirkulierende Tumorzellen (circulating
tumor cells, CTCs) können für eine
effektive und zielgerichtete Behandlung
von Krebserkrankungen von Nutzen sein. Sie
lösen sich vom Primärtumor und gelangen
in den Blutkreislauf. Von dort können sie
auch weitentfernte Organe erreichen. Aus
diesem Grund entstehen oft tödliche Metastasen
auch nach erfolgreicher Beseitigung
eines Krebsgeschwürs. Durch die erstmalige
Beobachtung (1869) dieser den Tumorzellen
ähnelnden Zellen ergab sich ein neues diagnostisches
Potential 1 . Lange war es jedoch
nicht möglich, zirkulierende Tumorzellen
erfolgreich aus dem Blutstrom zu extrahieren.
Allein durch die Abschätzung der Zahl der
im Blut zirkulierenden Tumorzellen können
Rückschlüsse auf den Status der Tumorerkrankung
gezogen werden. Eine genauere Analyse
einzelner Zellen führt zusätzlich zu einem
verbesserten Verständnis der Biologie der
verschiedenen Krebsarten und Metastasen.
Der geringe Anteil an erkrankten Zellen im
Blut erschwert aber die erfolgreiche Filterung.
Es befindet sich nur etwa eine zirkulierende
Tumorzelle unter mehreren hundert Millionen
Blutzellen.
Exitierendende Extraktionsmethoden
für zirkulierende Tumorzellen
In den letzten Jahren hat die Krebszellforschung
erhebliche Fortschritte gemacht, auch
bei der Analyse zirkulierender Tumorzellen. Es
ist bereits möglich, einzelne Zellen aus dem
Blut zu filtern und zu analysieren. Der Aufwand
– sei es an Zeit oder an Geldmitteln – ist
aber meist noch enorm. Es werden verschiedenste
Technologien ineinander geschachtelt,
um mit einzelnen Zellen arbeiten zu können.
Im Fall der zirkulierenden Tumorzellen heißt
das, dass durch mehrere Filtervorgänge die
Zahl der nicht gesuchten Blutzellen stetig
verringert wird.
Der einfachste Ansatz der Filterung ist physikalischer
Natur. Dazu wird der Größen- und
Elastizitätsunterschied zwischen entarteten
und gesunden Zellen genutzt. Zirkulierende
Tumorzellen sind normalerweise etwas
größer und lassen sich weniger deformieren
als zum Beispiel rote Blutkörperchen. Dieses
Wissen führte unter anderem zu mechanischen
Membranfiltern 2 . Einige weiße Blutkörperchen
überschneiden sich aber in der
Größenbandbreite mit den CTCs. Das führt
zu nicht-eindeutigen Ergebnissen in der Filterausbeute
– das Verhältnis zirkulierender
Tumorzellen zu den restlichen Blutzellen wird
also zwar minimiert, aber sie werden nicht
vollständig voneinander getrennt.
Eine weitere Möglichkeit zur CTC-Aufreinigung
ist der Einsatz von Antikörper-beschichteten
Oberflächen, an denen das Blut vorbeigeführt
wird. EpCAM-Proteine (epithelial
cell adhesion molecule) können Tumorzellen
epithelialen Ursprungs gezielt einfangen,
während Blutzellen nicht an den Faktor binden.
Tumorzellen anderen Ursprungs können
durch spezielle Bindungsfaktor-Cocktails 3
angereichert werden. Die Wahrscheinlichkeit,
dass eine zirkulierende Tumorzelle die spezielle
Oberfläche berührt, ist dabei entscheidend
für die erfolgreiche Extraktion. Eine Lösung ist
die Generierung von Mikrosäulen in den Kanälen
des CTC-Chips. Durch sie wird ein großes
Oberflächen- zu Volumenverhältnis 4 erzielt.
Eine unregelmäßige Anordnung solcher Säulen
erhöht die Kontaktwahrscheinlichkeit 3 .
Ein zweiter Ansatz, die Wahrscheinlichkeit
des Aufeinandertreffens des Fängermoleküls
mit einer CTC zu erhöhen, kommt ohne Mikrosäulen
aus. Fischgrätenförmige Muster an
Wänden der Kanäle des CTC-Chips führen zu
genügend Turbulenzen, um Kolli sionen der
„Fängermoleküle“ mit den zirkulierenden
Tumorzellen herbeizuführen 5 .
Um neuartige Antikörper für alle bekannten
und noch unbekannten Tumorzellen zu finden,
werden allerdings eine große Zahl an einzelnen
zirkulierenden Tumorzellen benötigt.
Erst nach erfolgreicher Charakterisierung aller
Zellen kann eine optimale Ausbeute erfolgen.
Das heißt aber, eine Affinitätsfilterung allein
führt derzeit noch nicht zum gewünschten
Resultat.
Kombination von Vorteilen
Abb. 1: Dynamischer Mikrofluidik-Chip. (a) Magnetische Partikel, (b) Kettenbildung und
Erzeugen der Filterstruktur, (c) Mechanische und biomagnetische Filterung, (d) Ausspülen
der Blutzellen und Isolation der Krebszellen.
Durch unterschiedliche Abstände von funktionalisierten
Mikrosäulen können die mechanische
und Affinitäts-Filterung kombiniert
werden 6 . Dadurch wird eine hohe Filter-
12 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT

Mikrofluidik Krebszellanalyse
effizienz erreicht. Unsere Forschungsgruppe
an der Fachhochschule St.Pölten beschäftigt
sich derzeit mit der Entwicklung eines
Simulationstools für Microfluidik-Chips im
Rahmen des Projekts „Tunable microfluidic
chips for isolating circulating cancer cells“
der Life Science Krems GmbH. In dieser
Arbeit werden magnetische Teilchen mit
Antikörpern funktionalisiert. Mit Hilfe eines
externen Magnetfeldes können dann gezielt
Filterstrukturen, zum Beispiel in CTC-Chips,
erzeugt werden. Durch die Kombination von
mechanischen Filterketten und den affinen
Partikeln lässt sich eine besonders gute Filtereffizienz
erzielen.
Abbildung 1 zeigt den Ablauf einer Filterung
von zirkulierenden Tumorzellen:
a. Zu Beginn werden die oben erwähnten
weichmagnetischen Partikel in einen Microfluid-Chip
beliefert. Diese Teilchen sind
mit speziellen Antikörpern beschichtet, an
die die Tumorzellen sich anheften.
b. Durch Anlegen eines magnetischen Gradientenfeldes
bilden diese magnetischen
Beads Ketten in genau definierten Positionen.
Deren Abstände können durch
Veränderung des Magnetfeldes gesteuert
werden.
c. Sobald diese Partikelketten in Position
sind, beginnt die Zuleitung der Blutprobe.
Durch die Kombination von Größenfilterung
und Affinitätsbindung mit speziellen
Antikörpern bleiben nur die zirkulierenden
Tumorzellen haften.
d. Diese können dann mit einem Mikroskop
analysiert und für weitere Tests verwendet
werden.
Optimierung der Filtereffizienz durch
Simulationen
Abb. 2: (a) Computermodell eines roten
Blutkörperchens. (b) Simulation der
Deformation einer Brustkrebszelle
an der Filterstruktur
Wie auch in vielen anderen Bereichen können
Computersimulationen das Verständnis von
teuren, komplizierten oder schlecht erkennbaren
Vorgängen verbessern. Alle derzeit
verfügbaren Filtermethoden konnten bisher
nur durch „trial-and-error“-Experimente
entwickelt werden. Das führte zwar zu teilweise
ansprechenden Resultaten, aber eine
vollständige Trennung der Zellen konnte noch
nicht erreicht werden. An der Fachhochschule
arbeiten wir derzeit mit Hochdruck an einer
Simulationsumgebung für einen vollständigen
Filtervorgang zirkulierender Tumorzellen.
Die Problemstellung verbindet Mikromagnetismus,
Strömungs- und Zellularmechanik.
EpCAM-behaftete weichmagnetische Partikel
bewegen sich in einem magnetischen Gradientenfeld.
Im Zusammenspiel mit Kräften
der Blutströmung kann die genaue Position
der magnetischen Partikel im Mikrofluid-Chip
berechnet werden. Dadurch können, wie in
Abbildung 1 gezeigt, Kettenstrukturen erzeugt
werden. Das Zusammenspiel eines homogenen
und des Gradientenfeldes emöglicht zudem
die Variation der Filterabstände zwischen
diesen Ketten 7 .
Das Modell der Blutzelle wird als eine
Oberflächenmembran mit interagierenden
Teilchen beschrieben 8 . Ein spezielles Masse-
Feder-System ermöglicht die genaue Nachbildung
realer Strömungsbewegungen. Ein rotes
Blutkörperchen besteht aus einem Zytoskelett
und einer umschließenden Membran. Für die
Computermodellierung wird nur die Membran
zu Rate gezogen (Abb. 2a). 400 Oberflächenteilchen
sind funktionell miteinander
verbunden. Es wirken eine konstante Oberflächen-
bzw. Volumenkraft, eine Federkraft
und eine winkelabhängige Kraft. Mit einer
optimalen Einstellung dieser vier Parameter
kann ein nahezu reales Verhalten gesunder
und kranker Blutzellen nachgestellt werden.
Hauptaugenmerk werden auf das konstante
Oberflächen und Volumen von Blutzellen gelegt.
Den Rest erledigen Federkräfte zwischen
den Teilchen und winkelabhängige Belastungen
der Membranoberfläche. Zur Validierung
werden die Modelle real durchgeführten Belastungsproben
gegenübergestellt. Beispielsweise
werden Blutzellen mit einer optischen
Laserpinzette in die Länge gezogen 9 . Das
Verhältnis von Längen- zu Breitendurchmesser
bei konstanter Kraft ist ein wichtiger Faktor
für ein korrektes Modell. In ähnlicher Weise
lassen sich Krebzellen simulieren. Abbildung
2b zeigt die Deformation einer Brustkrebszelle
beim Durchgang zwischen zwei Ketten aus
magnetischen Partikeln.
Zusammenfassung und Ausblick
Die Zahl der Technologien zur Isolierung von
zirkulierenden Tumorzellen hat in den letzten
Jahren stark zugenommen. Jede einzelne
dieser Methoden scheitert aber derzeit noch
an einer kompletten Trennung von den restlichen
Blutzellen. Die Kombination von mechanischer
und Affinitäts-basierter Filterung
ermöglicht es, die Effizienz zu erhöhen. Für
eine eindeutige Diagnose fehlt es aber an der
Genauigkeit der erwähnten Mechanismen.
Aufgrund der methodenabhängigen Ausbeute
ist ein Vergleich verschiedener Technologien
schwer möglich. Unser Team entwickelt
derzeit eine Simulationsumgebung, um die
Isolaterung zirkulierender Tumorzellen zu
optimieren. Diese Resultate werden wichtige
Erkenntnisse für den Bau zukünftiger
„lab-on-a-chip“-Methoden liefern. Es werden
dringend große Mengen an einzelnen Tumorzellen
benötigt, um molekularbiologische
Untersuchungen durchführen zu können.
Der Bildung von Metastasen kann nur durch
ausreichendes Wissen über die zirkulierenden
Tumorzellen entgegengewirkt werden.
Danksagung
Die Autoren bedanken sich für aufschlussreiche
Diskussionen mit Dr. Martin Pecherstorfer,
Dr. Martin Brandl, Dr. Hubert Brückl und
Dr. Ivan Cimrak und für die finanzielle Unterstützung
der Life Science Krems GmbH.
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determination of the shear modulus of the human erythrocyte
membrane using optical tweezers (1999).doi:16/
S0006-3495(99)77279-6
Korrespondenzadresse
Dr. Thomas Schrefl
Fachhochschule St. Pölten
Matthias-Corvinus-Straße 15
3100 St. Pölten, Österreich
Tel.: +43-2742-313228-313
Fax: +43-2742-313228-609
thomas.schrefl@fhstp.ac.at
www.laborwelt.de
LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 13

Krebszellanalyse Krebsmarker
Validierung neuer Protein-
Biomarker im Kampf
gegen Prostatakrebs
Dr. Kathrin Endt, Dr. Ralph Schiess, ProteoMediX AG, Schlieren, Schweiz
Prostatakrebs zählt zu den am häufigsten diagnostizierten Krebsarten bei Männern und
ist bei diesen nach Lungen- und Darmkrebs die dritthäufigste Todesursache. Im Jahr 2008
wurde weltweit bei circa 900.000 Männern Prostatakrebs diagnostiziert, und 258.000 erlagen
dieser Erkrankung. Dabei waren rund 30% der Betroffenen älter als 50 Jahre. Für eine
erfolgreiche Behandlung von Prostatakrebs sollte die Erkrankung in einem möglichst frühen
Stadium detektiert werden. Daher bemühen sich Forscher mit großer Anstrengung, bereits
existierende Diagnosemöglichkeiten qualitativ zu verbessern und neue prognostische oder
diagnostische Biomarker zu entdecken sowie zu validieren.
Heute gängige Untersuchungsmethoden zum
Nachweis des Prostatakarzinoms beinhalten die
Bestimmung des PSA-Wertes im Patientenblut
und eine Tastuntersuchung der Prostata. Der
PSA-Wert bezieht sich dabei auf das sogenannte
prostataspezifische Antigen – ein Protein, welches
bei Prostatakrebs, aber auch bei Entzündungen
oder einer Vergrößerung der Prostata
vermehrt im Blut gemessen werden kann. Liefern
sowohl die Tastuntersuchung als auch ein
erhöhter PSA-Wert Hinweise für einen Verdacht
auf Prostatakrebs, wird oft ein invasiver Eingriff
– eine Biopsie –durchgeführt. Allerdings birgt
der PSA-Test den großen Nachteil einer sehr
hohen Rate an falsch-positiven Prostatakrebs-
Diagnosen (bis zu 75%), was häufig eine unnötige
Biopsie mit Nebenwirkungen wie Blutungen
und Inkontinenz zur Folge hat. Bis heute wurde
zudem kein optimaler PSA-Schwellenwert
definiert. Eine Senkung dieses Wertes birgt die
Gefahr, dass insignifikanter Krebs behandelt
wird, welcher im natürlichen Lebensverlauf nur
mit sehr geringer Wahrscheinlichkeit lebensbedrohlich
würde. Überbehandlung ist somit
eines der größten Risiken bei der Prostatakrebs-
Diagnose 1, 2 . Aus diesem Grund ist die Suche und
Validierung von weiteren Markern, welche die
Spezifität der Prostatakrebs-Diagnose verbessern
und eine Aussage über die Aggressivität
ermöglichen, unabdingbar. Mit Hilfe der quantitativen
Massenspektrometrie konnten wir nun
neue, sehr spezifische Biomarker im Serum von
Prostatakrebspatienten ermitteln.
Quantitative Massenspektrometrie
als Biomarker-Screening-Strategie
Molekulare und genetische Biomarker spielen
eine entscheidende Rolle in der klinischen
Onkologie. Sie erlauben Prognosen darüber,
ob eine Person Krebs entwickeln wird, oder
geben Hinweise auf das jeweils vorliegende
Krebsstadium. Zudem helfen diagnostische
Biomarker dem Mediziner bei der Entscheidung
über Behandlungsoptionen und bei der
Identifizierung von Subpopulationen, die auf
eine bestimmte Therapie ansprechen 3, 4 . Eine
der größten Herausforderungen ist dabei das
Auffinden von Biomarkern im Blut oder anderen
Körperflüssigkeiten mittels nicht-invasiver
Detektionsmethoden, um eine patientenspezifische
medizinische Vorsorge und Behandlung
für Krebserkrankungen anbieten zu können.
Um neue prognostische und diagnostische
Proteinbiomarker im Serum von Krebspatienten
zu identifizieren, nutzen Wissenschaftler das
mittlerweile enorme Wissen über genetische
Veränderungen (Mutationen), die oft Veränderungen
in Signalwegen zur Folge haben, welche
die Entstehung von Krebs begünstigen.
Mittels Proteomanalysen, die auf quantitativer
Massenspektrometrie basieren, konnte
kürzlich gezeigt werden, dass Prostatakrebsspezifische
Mutationen zu einem gesteigerten
Vorkommen von Proteinbiomarken im Serum
führen 5 . Eine Inaktivierung des PTEN (Phosphatase
und Tensin-Homolog)-Gens führt dabei zu
einem veränderten Phosphatidylinositol-3-Kinase-
(PI3K)-Signalweg 6 , welcher eine veränderte
Produktion von Oberflächenproteinen und
sekretorischen Proteinen des Prostatagewebes
nach sich zieht 7 . Mit Hilfe eines Mausmodells,
das durch den Verlust des Tumorsuppressor-
Gens PTEN im Prostataepithelium charakterisiert
ist, konnten unter Anwendung massenspektrometrischer
Screening-Strategien 8
Proteine mit unterschiedlichen Expressionsmustern
in gesundem und krankem Gewebe
von Mäusen identifiziert werden 6 . Diese in der
Maus identifizierten potentiellen Biomarkerkandidaten
wurden anschließend im Serum von
77 Patienten mit lokalem Prostatakrebs sowie
einer Kontrollgruppe (66 Personen mit einer
gutartigen Prostatavergrößerung) gemessen.
Eine Untersuchung des Prostatagewebes von
Prostatakrebspatienten ergab, dass PTEN-
Defekte in mehr als 70% aller Fälle eine Rolle
spielen. Somit konnte auch die Relevanz des
Mausmodells bestätigt werden.
Neue prognostische und
diagnostische Biomarker
Abb. 1: Sechs charakteristische Kennzeichen für Krebs 10 . Die vier Serumbiomarker HYOU1,
ASPN, CTSD und OLFM4 decken vier Bereiche der sechs Hauptmerkmale verschiedener
Tumorstadien ab (abgeänderte Zeichnung von Hanahan et al., 2011).
Der Datensatz an gemessenen Proteinen
im menschlichen Blut konnte nun genutzt
werden, um geeignete Biomarkerkandidaten
zu selektieren und somit Vorhersagemodelle
aufzubauen, welche beispielsweise eine Unterscheidung
zwischen einem normalen oder
anomalen PTEN-Status erlauben. Mit Hilfe
von histologischen Gewebeuntersuchungen
konnten die biologischen Eigenschaften des
Tumors und seine Bösartigkeit genauer bestimmt
werden. Dadurch konnte bei einem
14 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT

Tab. 1: Vergleich der testspezifischen
Eigenschaften des PSA-Tests mit
einer kombinierten Messung von
PSA und den vier Serumproteinmarkern
(HYOU1, ASPN, CTSD, OLFM4).
Ein kombinierter Test von PSA und
den vier diagnostischen Biomarkern
liefert eine deutlich erhöhte Spezifität
von 79% und führt somit zu einer
Reduktion von falsch-positiven
Diagnosen.
PSA Test
(Goldstandard)
Proteinmarker
Genauigkeit 70 % 84 %
Sensitivität 87 % 85 %
Spezifität 45 % 79 %
ist somit eine ideale nicht-invasive Methode,
um die Anzahl an falsch-positiven Prostatakrebs-Diagnosen
und somit unnötigen Biopsien
zu verringern. Zudem bieten diese neuen diagnostischen
Biomarker die Möglichkeit mit hoher
Präzision, Stabilität und Reproduzierbarkeit
Prostatakrebs detektieren zu können.
Prospektive Validierungsstudien
Eine momentane Limitierung der Anwendbarkeit
und Aussagekraft des beschriebenen
Diagnostik-Tests ist die Anzahl der analysierten
humanen Proben und die ausschließlich retrospektiv
durchgeführten Messungen. Daher soll
zukünftig die Aussagekraft des auf der Messung
des PSA-Wertes und der vier Proteinbiomarker
basierenden Diagnostik-Tests in einer größeren
Patientenstudie prospektiv getestet werden.
Da Messungen, die auf der Technik von Massenspektrometern
beruhen, nur bedingt für
das Screenen einer großen Anzahl von Patientenseren
geeignet sind, sollen die Proteinmessungen
mit einer einfacheren Methode, dem
sogenannten ELISA-Test, durchgeführt werden.
Das schweizerische Start-Up Unternehmen
ProteoMediX AG ist mit der Entwicklung eines
solchen Tests beschäftigt und hofft, möglichst
bald ein entsprechendes Produkt auf den Markt
zu bringen. Bewahrheitet sich die Aussagekraft
des neuen Diagnostik-Tests in den geplanten
klinischen Studien, können unzähligen Männern
unnötige Gewebeentnahmen und damit
verbundene Komplikationen erspart werden
sowie Unsicherheit und Angst, die mit einem
erhöhten PSA-Wert einhergehen. Ferner kann
dieser Test auch zu einer bedeutenden Senkung
der Gesundheitskosten beitragen, da die Zahl
falsch-positiver Diagnosen verringert wird.
European
Biotechnology
Network
PTEN-Gendefekt festgestellt werden, dass der
Verlust des PTEN-Gens im Prostatagewebe
mit einer beschleunigten Prostatakrebs-
Progression und -Aggressivität einhergeht 9 .
Es besteht demnach eine kausale Verbindung
zwischen der Bewertung der Aggressivität eines
Tumorgewebes und der Funktionalität des
PTEN-Gens. In diesem Kontext konnten mittels
bioinformatischer Methoden eine Handvoll
Proteinbiomarker im Serum von Prostatakrebspatienten
aufgefunden werden, welche
die beschriebene Korrelation zwischen PTEN-
Verlust und Krebsprogression verdeutlichten
und sich somit für die nicht-invasive Abklärung
von Prostatakrebsstadien eignen.
Unter den ermittelten krebsspezifischen
Biomarkerkandidaten konnten neben den
prognostischen Biomarkern auch vier Proteine
im Blutserum identifiziert werden, die
Biotechnology Network!
Join the European
eine zuverlässige Prostatakrebsdiagnose
ermöglichen, wenn sie mit dem PSA-Test
The European Biotechnology Network
kombiniert werden. Mit Hilfe von bioinformatischen
Filtern wurden folgende vier Proteine
is dedicated to facilitating co-operation
between professionals in biotech-
identifiziert: Hypoxia up-regulated protein 1 Literatur
(HYOU1), Asporin (ASPN), Cathepsin D (CTSD)
nology and the life sciences all over
und Olfactomedin-4 (OLFM4). Dabei decken [1] Schröder, F.H., et al., ERSPC Investigators, N Engl J Med 360
Europe. The network is run by the European
Biotechnology Foundation, a
die vier Proteine zwei Drittel der biologischen (2009), 1320-1328
[2] Andriole, G.L., et al., PLCO Project Team, N Engl J Med 360
Hauptmerkmale in der Krebsentwicklung (2009), 1310-1319
ab non-profit organisation based in Brussels.
Do you want to know more about
10 . CTSD ist zum Beispiel involviert in die [3] Tainsky, M.A. Biochim Biophys Acta (1796), 176-193
Tumorinvasion und Metastasierung, OLFM4 [4] Ludwig, J.A., Weinstein, J.N., Nat Rev Cancer 5 (2005), 845-
856
verhindert den Zelltod, ASPN hilft einer Zelle, [5] Cima, I., Schiess, R., et al., Proc Natl Acad Sci USA 108 (2011), the advantages of a (free) membership
Just have a look at our website:
Wachstumssuppressoren zu entgehen, und 3342-3347
[6] Maehama, T., Dixon, J.E., J Biol Chem 273 (1998), 13375-
HYOU1 induziert die Angiogenese (Abb. 1).
13378
www.european-biotechnology.net
Das Messen dieser vier Proteinmarker in [7] Mehrian-Shai, R., et al., Proc Natl Acad Sci USA 104 (2007),
Kombination mit dem PSA-Test lieferte bei 5563-5568
[8] Schiess, R., Wollscheid, B., Aebersold, R., Mol Oncol 3 (2009),
ersten Messungen bereits eine sehr hohe Spezifität
von 79%, das heißt, in fast 80% der Fälle [9] McMenamin, M.E., et al., Cancer Res 59 (1999), 4291-4296
33-44
traf eine positive Vorhersage auch wirklich zu. [10] Hanahan, D., Weinberg, R.A., Cell 144 (2011), 646-674
Verglichen mit der PSA-Messung allein, die im
gemessenen Kollektiv eine Spezifität von 45%
aufwies, bedeutet dieser Wert eine Steigerung Korrespondenzadresse
European Biotechnology Foundation
von rund 43% (Tab. 1). Dieses Ergebnis konnte in
Rue d‘Egmont 15
einer weiteren unabhängigen Messung für 37 Ralph Schiess, CEO
B-1000 Bruxelles, Belgique
Probanden (14 Personen mit lokalem Prostatakrebs;
23 mit gutartiger Prostatavergrößerung) Wagistr. 23
ProteoMediX AG
Tel: +32 2 50 08 531
bestätigt werden. Ein auf dem PSA-Wert und CH-8952 Schlieren
Fax +32 2 64 92 989
dem Messen der vier Proteine basierender Test ralph.schiess@proteomedix.com
info@european-biotechnology.org
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LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 15

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Biotechnology
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Health (NIH), Department of Defense (DOD) and the Bill and
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Sequence Capture Zielgen-Anreicherung
Auffinden einer Mutation
für erblichen Gehörverlust
mit Capture Arrays
Genanreicherung
II
Dr. Burkhard Ziebolz, Roche Applied Science, Penzberg
Erblicher Gehörverlust ist mit einer Häufigkeit von mindestens zwei Fällen auf 1.000 Neugeborene
die häufigste sensorische Funktionsstörung beim Menschen. Rund 70% der Erkrankungen sind
nicht-syndromisch (NSHL), das heißt, es treten keine zusätzlichen Symptome auf. Zwischen 1% und
5% der NSHL-Fälle sind durch X-chromosomale Mutationen bedingt, die bislang vier NSHL-Genloci
(DFNX) zugeordnet werden konnten. Im Zuge einer Familienstudie konnten Hübner et al. 1 eine
X-chromosomal-dominant vererbte Form des fortschreitenden Hörverlustes der chromosomalen
Region Xp22 (DFNX4) zuordnen. Mit Hilfe der gezielten Sequenz-Anreicherung durch Hybridisierung
genomischer DNA der Mitglieder einer deutschen Familie auf NimbleGen Capture Arrays (Roche
NimbleGen Inc., Madison), die die genomische Zielregion repräsentierten, identifizierten Hübner und
Kollegen nun eine nonsense-Mutationen im Gen für SMPX (small muscle protein, X-linked). Xp22
war bereits zuvor bei einer spanischen Familie als krankheitsrelevant angenommen worden, ohne
dass aber eine ursächliche Mutation identifiziert werden konnte. Von Hübner et al. durchgeführte
Sequenzanalysen bestätigten nun, dass auch hier eine Nonsense-Mutation in SMPX krankheitsrelevant
ist. Weitere Studien ergaben, dass das mechanosensitive, Zytoskelett-assoziierte SMPX-Protein
in den Stereocilien der Haarzellen und der Cochlea des Innenohrs von Mäusen exprimiert wird, die zur
mechanosensorischen Transduktion beim Hörvorgang beitragen. Das Auftreten von Stopp-Codons in
SMPX-Transkripten deutet darauf hin, dass es über einen nonsense-vermittelten mRNA-Abbau zum
Funktionsverlust des SMPX-Proteins kommt. Die Forscher vermuten, dass SMPX zur Erhaltung
der ständig unter mechanischem Stress stehenden Haarzellen des Innenohrs beiträgt.
Zahlreiche Anwendungen des Next-
Generation-Sequencings zielen auf die
Untersuchung ganz bestimmter interessierender
genomischer Regionen ab.
Damit der Einsatz der Ultrahochdurchsatz-
Instrumente wirtschaftlich wird, müssen
deshalb die interessierenden Loci mittels
PCR vervielfältigt werden, zumindest bei
den Sequenzern der 2. Generation am
Markt, die mittels Fluoreszenz-Readout
die Sequenz bestimmen. Nicht amplifiziert
wäre das Signal viel zu schwach, um
detektiert zu werden. Die Amplifikation
ist indes nicht trivial: Gilt es doch, alle zu
sequenzierenden Abschnitte um genau
denselben Faktor zu vervielfältigen. Diese
aufwändige Probenvorbereitung – die
Targetgenanreicherung –, die bei Single
Molecule Sequenzieransätzen wegfällt,
ist der eigentliche Flaschenhals bei der
Next-Generation-Sequenzierung.
Elution & PCR
Hochparallele Sequenzierung
auf Next Generation-Sequenzern
Fragmentierung und Hybridisierung genomischer
DNA an SeqCap TM -Microarrays, die
Zielsequenzen enthalten
Analyse der angereicherten Sequenzen
Abb. 1: Ablauf der Targetsequenz-Anreicherung mit NimbleGen SeqCap TM -Arrays
Suche nach der besten Automation
Ein möglicher Ansatz, genomische Regionen
anzureichern, ist die Hybridisierung
gegen eine Bibliothek von DNA-Sonden
auf einem Array. Wie leistungsfähig das
zum Beispiel das von der NimbleGen Inc.
entwickelte Verfahren ist, haben Hübner
und Kollegen unlängst gezeigt. In einer
Familienstudie konnten sie mittels sogenannter
SeqCap-Microarrays ein Gen
für die erbliche Innenohrschwerhörigkeit
identifizieren und erste Hinweise auf dessen
Funktionsweise finden (vgl Seite 17).
Zur Serienreife entwickelt haben der US-
Mikrofluidik-Experte Raindance und der
Kunststoff-Spezialist Sony DADC Austria
einen Mikrofluidikchip, der es ermöglicht,
Millionen von Mikrotröpfchen herzustellen,
in denen jeweils eine getrennte
PCR-Reaktion abläuft (vgl. Seite 20). Eine
Automation der PCR-Probenvorbereitung
für Next-Generation-Sequencing-Anwendungen
für den Genome Sequencer
FLX (Roche Applied Science) bietet seit
kurzem die Firma Hamilton Robotics an
(siehe Seite 22).
LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 17

Zielgen-Anreicherung Sequence Capture
Laborwelt Hintergrund
Prinzip der Schallübertragung im Innenohr
Schall wird vom Trommelfell über die Gehörknöchelchen
des Mittelohrs im sogenannten
ovalen Fenster auf die Cochlea (Schnecke, im
Bild blau) übertragen. Die Cochlea ist im
Querschnitt in drei Röhren unterteilt: Die
Scala vestibuli (oberer Gang) ist mit dem
ovalen Fenster verbunden. Sie nimmt den
Schalldruck auf und führt ihn bis zur Spitze
der Cochlea, dem Helicotrema. Dort führt
eine scharfe Kehre in die zurücklaufende
Röhre, die Scala tympani (untere Röhre), die
am runden Fenster des Innenohrs endet.
Zwischen den beiden Röhren liegt die Scala
media, die den sensorischen Apparat, das
Corti-Organ (große Abbildung), enthält.
Trifft Schall über das ovale Fenster ein, bildet
sich eine Wanderwelle, deren Maximum bei
hohen Frequenzen den vorderen Abschnitt,
bei tiefen Tönen den dünneren, hinteren
Abschnitt der Basilarmembran zum Schwingen
anregt. Die Frequenzinformation wird
so in eine Ortsinformation umgewandelt.
Basilar- und Tektorialmembran werden nun
gegeneinander verschoben. Dies stimuliert
die äußeren Haarzellen (OHC), ihre Länge
zu ändern, was die lokalen Bewegungen im
Cortiorgan etwa 1000-fach verstärkt. Die so
verstärkte Wanderwelle erregt nun lokal die
inneren Haarzellen (IHC), die das sensorische
Signal erzeugen.
BC
RC
Derzeit sind vier X-chromosomale vererbte
Loci (DFNX) kartiert, die mit dem Auftreten
des nicht-syndromischen Gehörverlustes
(NSHL) in Zusammenhang stehen. DFNX1
ist durch eine fortschreitende Beeinträchtigung
des Hörvermögens gekennzeichnet
und tritt typischerweise im Alter zwischen 5
und 15 Jahren bei Männern sowie bei Frauen
um die 50 auf. Welche Rolle das bei DFNX1
mutierte PRPS1-Gen, das ein Enzym der
Nukleotidbiosynthese kodiert, im Innenohr
spielt, ist unklar 2 . Ebenso fanden sich Mutationen
3 im Transkriptionsfaktor Pou3F4 bei
Patienten mit DFNX2. Hierbei kommen die
Kinder bereits mit stark eingeschränktem
Hörvermögen (prälingualer Hörverlust) zur
Welt, weil die Schallübertragung zwischen
Mittel- und Innenohr gestört ist. Hübner et
al. untersuchten einen dritten, postlingualen
NSHL in einer großen deutschen Familie. Die
Krankheit beginnt bei Jungen im Alter von
3 bis 7 Jahren, mit Hördefekten im oberen
Frequenzband, schreitet aber progressiv
bis zur Taubheit fort. Bei Frauen beginnt
der Hörverlust zwischen dem 20. und 30.
Lebensjahr und führt nach 10 bis 15 Jahren zu
schweren Hörschädigungen, ohne dass zuvor
Störungen der Schallweiterleitung aus dem
Mittelohr oder eine Beeinträchtigung des
Gleichgewichtssinnes zu bemerken wäre.
Genomweite Kopplungsanalyse
Eine genomweite Kopplungsanalyse (Gene
Chip Human Mapping 10K Array, Affymetrix)
deutete bei 11 der Familienmitglieder mit
sehr hoher Wahrscheinlichkeit (LOD-Score
2.23) darauf hin, dass der Defekt sich in einer
17,5 Mb-Region auf dem Chromosomenabschnitt
Xp22.12 befindet. Die Berechnung
der LOD-Scores erfolgte mit dem Programm
ALLE GRO 4 unter der Annahme einer dominanten
Vererbung mit vollständiger Penetranz.
Die Allelfrequenz der pathogenen Variante
wurde auf 0,0001 gesetzt. Die mit MERLIN 5
konstruierten Haplotypen für SNP-Marker
auf dem Chromosomenabschnitt Xp22.12
engten den Krankheits-Locus auf die Region
zwischen rs1482816 und rs1557901 ein.
Identifikation des ursächlichen Gens
mit NimbleGen SeqCap TM Arrays
Um die dem Hörverlust zugrundeliegende
Genmutation zu identifizieren, wurden alle
Exons und je 1KB der Promotoren der 88
proteincodierenden Regionen der Zielregion
zweier betroffener Männer sowie bekannte
miRNAs mit dem Roche NimbleGen 385K
Custom Sequence Capture Array angereichert
(Dienstleister: ATLAS Biolabs GmbH)
und sequenziert (Dienstleister: Cologne
Center for Genomics). Der Chip repräsentierte
dabei 96,3% der Zielsequenzen des
Krankheitslocus. Insgesamt wurden die
Targetgensequenzen um den Faktor 280
bzw. 284 angereichert, wie qPCR-Kontrollen
ergaben. Nach Elution der hybridisierten
Sequenzen vom Array und Amplifikation
wurden diese sequenziert (Illumina GA IIx)
und lieferten 2,8286 Gb bzw. 2,6060 Gb
Rohsequenz. Die Reads wurden mit der MAQ
short read-Alignment-Software 5 gegen das
humane Referenzgenom (Version hg19)
kartiert. Einzelbasen-Variationen (SNPs)
wurden mittels MAQ, Indels mittels dem
BWA-Aligner 6 und SAM-Tool 7 analysiert.
Auf diese Weise identifizierten Hübner und
Kollegen 3.858 bzw. 3.443 X-chromosomale
Varianten in den beiden Personen.
Zugleich wurden DNA-Proben weiterer
betroffener Männer dieser Familie hinsichtlich
hochpolymorpher Mikrosatelliten-
Marker genotypisiert. Die Kopplungsregion
konnte so auf eine 8,5 Mb-Region eingeengt
werden, die nur noch 398 bzw. 347 single
nucleotide-Varianten (SNVs) enthielt. Diese
wurden hinsichtlich ihrer evolutionären Konserviertheit
und ihrer Auswirkungen auf die
Proteinbiosynthese weiter analysiert. Nach
Sanger-Sequenzierung des aussichtsreichsten
Kandidaten – einer nonsense-Mutation
des small muscle protein, X-linked (SMPX)
– zeigte sich, dass das Sequenzintervall den
DFNX4-Locus enthielt.
Dieser X-chromosomale Locus war 1996
bereits von Forschungspartnern von Hübner
et al. in einer spanischen Familie kartiert
worden 8 und steht in Zusammenhang mit
dem Auftreten eines fortschreitenden, postlingualen
Hörverlust. Bei Männern tritt die
Erkrankung allerdings erst zwischen dem 5.
und 7. Lebensjahr, bei Frauen erst im vierten
Lebensjahrzehnt auf. Die retrospektive
Analyse von SMPX in dieser Familie lieferte
gleichfalls eine nonsense-Mutation (c175
G>T) in der proteinkodierenden Sequenz.
Ebenso wie die in der deutschen Familie
identifizierte Mutation (c.109G>T) scheint
diese über vorzeitige Stopp-Codons einen
18 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT

Sequence Capture Zielgen-Anreicherung
Porvair hairdryer Laborwelt DE 116.5x90_Layout 1 07/03/2012 17:25 Page 1
ACHEMA
Halle 4.2 E44
ANALYTICA Halle B2 215
mRNA-Abbau und damit Funktionsausfall des SMPX-Proteins zu
verursachen. Gestützt wird diese Hypothese durch zwei weitere,
unabhängige Familienstudien 9 , die ebenfalls zeitgleich zeigen, dass
SMPX das mutierte Gen bei der DFNX4-vermittelten Taubheit ist.
Immunlokalisation von SMPX
Immunlokalisationsstudien mit SMPX-Antikörpern ergaben, dass
SMPX in verschiedenen Zellen des Innenohrs von Mäusen exprimiert
wird (vgl. Hintergrund): Neben der Expression in nichtsensorischen
Zellen wie Deiters- (DC), Böttcher- (BC) oder Pillar-Zellen (PC) zeigte
sich auch eine schwache Expression in Haarzellen (iHC, oHC). Hübner
et al. vermuten, dass SMPX zur Erhaltung der mechano-sensitiven
Stereocilien auf den sensorischen Haarzellen der Cochlea erforderlich
ist.
Sie sehen gewisse Parallelen zur Funktion von SMPX in Muskelgewebe
des Menschen 10-12 . Dort ist das 88 Aminsäuren-Protein in
sogenannten Costameren lokalisiert – mechano-sensitiven Proteinkomplexen
die die Sarcolemmamembran vor Schäden durch mechanischen
Stress bei der Muskelkontraktion schützen.
Literatur
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Zielgen-Anreicherung Mikrofluidik
Kunststoff-Know how:
Basis für Lab-on-Chips zur
Zielgen-Anreicherung
Dr. Manfred Koranda, Sony DADC Austria AG, Salzburg
Bereits vor zwei Jahren berichtete RainDance Technologies Inc. von einem skalierbaren Multiplex-
PCR-Verfahren auf Basis seiner Mikrotröpfchen-Technologie, mit dem sich interessierende genomische
Regionen vor Sequenzierung gezielt anreichern lassen (vgl. LABORWELT 3/2009). Dank dem
Fertigungs-Know-how von Sony DADC steht nach zweijähriger Kooperation jetzt ein hochdurchsatzfähiger
Chip zur Verfügung, der einen wirtschaftlichen Einsatz der Next Generation-Sequenzierung
zur Untersuchung von krankheitsassoziierten Genen, SNPs, chromosomaler Hot Spots etc, ermöglicht.
Neben der Targetgen-Anreicherung soll der Chip künftig auch zur Zellsortierung eingesetzt
werden. RainDance nimmt durch die von Sony DADC produzierten „Smart Consumables” erfolgreich
am Wettbewerb um den Hochdurchsatz-Markt für Life Sciences-Instrumente teil.
Die auf Mikro-Tröpfchen basierende, „highthroughput“-fähige
Kerntechnologie von
Rain Dance, RainStorm TM , erzeugt Millionen
aufeinanderfolgender Tröpfchen, die als
distinkte Reaktionsräume fungieren und
ein einzelnes Molekül, eine Zelle oder eine
Reaktion umschließen können (Abb. 1). Bei
der Targetgen-Anreicherung fungiert jedes
Tröpfchen als Reaktionsraum, in dem genomische
DNA auf ein Primerpaar trifft und mittels
PCR amplifiziert wird. Dazu werden auf einem
Mikrofluid-Chip zunächst Tröpfchen erzeugt, je
Abb. 2: Das Herzstück der gezielten Genanreicherung
durch Mikrotröpfchen-
PCR: der HeatWave TM -Chip
ein Tröpfchen mit genomischer DNA und mit
Primer zusammengeführt, fusioniert und die
Tröpfchen in PCR-Röhrchen gesammelt. Nach
hochparalleler PCR in den Millionen Tropfen
können die gezielt angereicherten DNA-Abschnitte
sequenziert werden (vgl. Abb. 1).
Das Flagschiff von RainDance ist das RDT
ThunderStorm System – eine vollautomatisierte
Instrumenten-Plattform für das gezielte
Next-Generation-Sequenzierung, die kompatibel
mit allen marktgängigen Sequenzern ist
und eine genaue Klassifizierung potentiell aller
Abb. 1: Um interessierende genomische Loci hochparallel anzureichen, werden beim Rainstorm TM -Verfahren zunächst mit einem Netzmittel stabilisierte
Tröpfchen von je 8 pl Volumen erzeugt, die PCR-Primerpaare (a) und genomische Template-DNA (b) enthalten. Je ein Tropfen der
Bibliothek mit bis zu 4.000 Primerpaaren und je ein Tropfen mit der genomischen DNA werden in separate Kanäle eines Mikrofluidikchips
geladen, paaren sich dort und werden in einer Kammer (c) durch ein elektrisches Feld (schwarze Dreiecke = Elektroden) fusioniert. Die
PCR-Tröpchen werden außerhalb des Chips in Standard-PCR Tubes gesammelt. Die enthaltene DNA wird anschließend in handelsüblichen
Thermocyclern im Tropfen amplifiziert. Dies ermöglicht ein Multiplexing in einem PCR-Röhrchen, das mehreren hundert bis tausend Amplifikation
unter den Bedingungen einer Singleplex-Reaktion entspricht.
20 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT

Mikrofluidik Zielgen-Anreicherung
Varianten in jeder Regionen eines Genoms
ermöglicht. Dies ist zum Beispiel bei der Erkennung
von krebsassoziierter Mutationen
hilfreich. Herzstück des ThunderStorm ist der
HeatWave TM TS-Probenchip (Abb. 2). Entwickelt
und produziert von Sony DADC ermöglicht
dieses „Smart Consumable“ die äußerst präzisen
Mikro-Tröpfchen-Manipulationen, die
für Hochdurchsatz-Analyse benötigt werden.
Der Chip kommt dabei ohne bewegliche Teile
oder Ventile aus.
Kombination von Fertigungsund
Assay-Know how
RainDance trat erstmals 2009 an Sony DADC
heran, als das Unternehmen mit der Herausforderung
konfrontiert war, einen funktionierenden
Prototypen aus PDMS in ein robustes
„high-throughput“-Einwegprodukt für die
Massenfertigung zu transformieren. Der
nur einmalige Gebrauch des Chips war eine
essentielle Voraussetzung, um eventuelle
Probenkontaminationen – eine große Gefahr
bei Genanalysen – auszuschließen. Besonders
attraktiv für RainDance war dabei Sony DADCs
anerkannte Fähigkeit, mikrofluidische Kanäle
in kostengünstigem Kunststoff anstatt in
teuren metallischen oder keramischen Chips
fertigen zu können – Schlüsselaspekt für die
tatsächliche Kosteneffizienz bei der Produktion
und damit für die Massentauglichkeit
des Systems.
Das Produkt sollte den gesamten biochemischen
Workflow (Abb. 1) abdecken: Einbringen
der gereinigten genomischen DNA,
Verpackung in Tröpfchen und anschließende
Fusion mit „Master-Mix“-Tröpfchen einer
Primer-Bibliothek, um diese für anschließende
PCR-Reaktionen einzusetzen (vgl. Abb. 1). Dies
war eine nicht zu unterschätzende Herausforderung,
denn schon der Prototyp des Chips war
komplex: mit Filterstruktur, Kanälen und Elektroden.
Zuerst lösten stellten die Designer von
Sony DADC sicher, dass die mikrofluidischen
Kanäle während des Bonding-Prozesses nicht
zerstört werden und ihr Durchmesser präzise
innerhalb des engen Toleranzbereiches liegt,
der ein reproduzierbares Tröpfchenvolumen
garantiert (± 1%). Des Weiteren war es notwendig,
die Elektroden genau positioniert zu
drucken, um exakt definierte Tröpfchenfusionen
zu induzieren. Mitentscheidend für die Fertigung
eines massentauglichen Chip war, dass
Sony DADC die gesamte Wertschöpfungskette
abdecken kann – von Mastering zu Spritzguss,
inklusive Elektrodendruck, Verklebung und Assemblierung
sowie Etikettierung, Verpackung
und Logistik. Ein weiterer Faktor war es, eine
langfristige Zusammenarbeit sicherstellen
zu können, wie für Sony DADC als weltweit
führenden Produzenten möglich.
Abb. 3: Stapelbar: der HeatWave TM TS-Chip
Die von Sony DADC produzierte Version des
HeatWave TM -Chips erhielt bei seiner Markteinführung
im Herbst 2011 das Lob der Kritiker und
unterstützt alle kommerziellen Anwendungen
des RDT ThunderStorm-Systems. Dies schließt
sowohl die „targeted ultra-deep cancer mutation
detection” als auch die firmeneigenen
Screening-Panels für Genanalysen mit ein:
ADMESeq, ASDSeq, XSeq und HLASeq.
Aufgrund des rapiden Fortschritts der
Genomforschung war RainDance von Beginn
an interessiert, einen Chip anzubieten, der
gleichzeitig zwei Proben analysieren kann.
Sony DADC hat dies ermöglicht: Der Heat-
Wave TM TS Chip wird im zweiten Quartal 2012
in die Massenproduktion gehen. Dank seiner
Stapelbarkeit (Abb. 3) und der Möglichkeit
der vollautomatisierten Probenbeladung verspricht
der neue Chip, die Produktivität auf
ein bis dato unbekanntes Niveau zu heben
und ermöglicht es Wissenschaftlern so, die
Analysenkosten pro Probe zu senken und den
Personalaufwand – verglichen mit anderen
Methoden – deutlich zu reduzieren.
Roch Kelly, Senior Vice President Operations
bei RainDance, zeigt sich mit der Zusammenarbeit
hochzufrieden: „Dank den zahlreichen
Vorteilen des von Sony DADC produzierten neuen
HeatWave TS Chips können unsere Kunden
ihre Proben schneller, einfacher und weitaus
kostengünstiger als jemals zuvor analysieren.
Sony DADC ist ein erstklassiger Zulieferer, der
auf jahrzehntelange Erfahrung in den Bereichen
der Fertigung optischer Disks und regulierte
Märkte zurückgreifen kann und somit eine
wertvolle Quelle für zukünftige Produkte im
Bereich „Smart Consumables“ darstellt.
Laut Christoph Mauracher, Senior Vice President
bei Sony DADC BioSciences, belegt die
Zusammenarbeit mit RainDance, dass Sony
DADC ein Schlüsselpartner für führende Life
Sciences-Unternehmen weltweit sein kann.
„Wir glauben, dass unsere Fähigkeit, hochentwickelte
Mikrostrukturen in Polymeren
herstellen zu können, kombiniert mit flexibler
Produktion und Logistik exakt die Kombination
liefert, wie sie von aufstrebenden und etablierten
Unternehmen in diesem aufregendem
Markt benötigt werden.“
Korrespondenzadresse
Manfred Koranda,
Sony DADC Austria AG
Sonystrasse 20
A-5081 Anif, Salzburg
Manfred.Koranda@sonydadc.com
www.sonydadc.com
Andy Noble,
RainDance Technologies, Inc.
44 Hartwell Avenue
Lexington, MA 02421
noblea@raindancetech.com
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LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 21

Zielgen-Anreicherung Automation
Automation der Zielgenanreicherung
für den
Genome Sequencer FLX
Darren Birr, 454 Life Science, Branford, USA
Die Standardisierung und Automatisierung der Probenvorbereitung für das Next Generation Sequencing
ist die Voraussetzung für die Erhebung in sich konsistenter Daten im Rahmen genomweiter
Sequenzierungsstudien. Eine Kombination der Microlab® Starlet Liquid Handling Workstation
(Hamilton Robotics) mit Roches REM e Liquid Handling-System reduziert die „hands-on“-Zeit der
Probenvorbereitung für die Sequenzierung auf dem Genome Sequencer FLX (454 Life Sciences/
Roche Applied Science) von 5 Stunden auf 15 Minuten. Zusätzlich vermindert die walk away-
Automatisierung des Emulsions-PCR-Schrittes sowie des Primer-Hybridisierungsschrittes bei der
Zielgenanreicherung die Variabilität der Sequenzierungsergebnisse im Vergleich zur manuellen
Probenvorbereitung.
Die Genome Sequencer FLX (GS FLX)-Plattform
(Roche Applied Science, Penzberg) bietet
Vorteile bei der de novo-Sequenzierung und
-Assemblierung genomischer DNA, beim
Transkriptom- und Amplicon-Sequencing
sowie bei der Analyse kleiner RNAs. Der
Arbeitsablauf auf dem GS FLX System besteht
aus vier Schritten: Dem Erzeugen der
Sequenzbibliothek, der klonalen Sequenz-
Amplifikation mittels Emulsions-PCR, der
Sequenzierung selbst und der bioinformatischen
Datenauswertung.
Roches REM e System ermöglicht eine
vollständige Automatisierung der Sequenzamplifikation
und des Annealings der Sequenzprimer
im Rahmen der Emulsions-PCR
mit GS FLX Titanium-Reagenzien (vgl. Abb.
2). Gegenüber der manuellen Probenvorbereitung
vereinfacht die Kombination einer
Liquid Handling-Plattform mit dem REM e
System die Durchführung der Emulsions-PCR
signifikant: Fünf Stunden manuelle Laborarbeit
werden durch einen reproduzierbaren,
vollautomatischen Prozess ersetzt.
Insgesamt stehen nach Positionierung
des REM e Moduls auf der Arbeitsfläche des
Microlab® STARlet Liquid Handling-Systems
fünf verschiedene, vollautomatisierte REM
e-Protokolle zur Verfügung, mit denen bis
zu acht Proben parallel bearbeitet werden
können.
Das REM e Modul übernimmt dabei das
Vortexen, die Vakuumfiltration, den Sequenz-
Capture-Schritt mit Magnetbeads und das
Erhitzen. Das Microlab® STARlet System
führt alle Flüssigkeitstransfer mit Hilfe
seiner voneinander unabhängigen 1.000 µl-
Pipettierkanäle durch.
In einer Testserie wurde ermittelt, ob die
Integration des REM e Systems in die Microlab®
STARlet Liquid Handling Workstation zu
vergleichbaren Anreicherungsergebnissen
führt wie die für Pipettierfehler anfälligere
und wesentlich langsamere manuelle Probenvorbereitung.
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06.03.2012 LABORWELT
12:27:50 Uhr

Automation Zielgen-Anreicherung
www.laborwelt.de
Das REM e System wurde gemäß Herstellervorgaben
installiert und die „Large Volume 4
Emulsion Cups per Run“-Methode mit Hilfe
der Hamilton-Software Vector 4.2.0.6425
programmiert. Emulsions-PCR-Amplifikationsansätze
wurden für vier zuvor generierte
GS FLX Titanium Rapid Libraries gemäß Herstellerangaben
angesetzt.
Nach Amplifikation mit der emPCR-Methode
für große Volumina (LV) wurde die Wasser-Öl-
Emulsion aufgebrochen (gemäß Manual: bis
Schritt 13/Abschnitt 3.5.3.), die Beads jeder
LV-Probe in einem konischen 50 ml-Röhrchen
vereint und mit Enhancing Fluid XT des emPCR
Kits auf 5 ml aufgefüllt.
Die Proben wurden dann gemäß REM e
System anleitung auf dem Hamilton Microlab®
STARlet plaziert und vier Emulsions-Cups
prozessiert, wie im REM e System-Protokoll
beschrieben.
Abb. 1: Das REM e System für den Next Generation Sequencer GS FLX (454/Roche Applied
Science), hier integriert in Hamiltons Liquid handling-Plattform Microlab® STARlet
Abb. 2: Arbeitsablauf der 454-Sequenzierung auf dem GS FLX System. Zunächst wird eine
Bibliothek einzelsträngiger Template-DNA erzeugt. Im zweiten Schritt erfolgt die
Bindung der Template-DNA an magnetische Beads, deren anschließende, „klonale“
Amplifikation via Emulsions-PCR, das „Aufbrechen“ der Wasser-Öl-Emulsion, die
Anreicherung DNA-positiver Beads und Auftrennung in die Kavitäten einer Picotiterplatte,
in der das Pyrosequencing stattfindet.
Methoden
Das hier eingesetzte Microlab® STARlet Liquid
Handling System war mit folgenden Komponenten
ausgestattet:
l autonome 1000 µl Pipettierkanäle (Hamilton)
l REM e System (454 Life Sciences)
l REM e System Tube Rack Carrier (Hamilton)
l REM e System Deck Module Carrier
(Hamilton)
l 3 x 120 ml Reagent Carrier (Hamilton)
l 120 ml Reagent Trough (Hamilton)
l Tip Carrier (Hamilton)
l 1000 µl CO-RE-Einmalpipettenspitzen
(Hamilton).
Tab. 1: Ergebnisse der Sequenzanreicherung von vier Proben auf dem REM e System. Zur
Erzeugung aller vier Bibliotheken wurden 35 Mio. Beads eingesetzt. LV = large volume
Bibliothek
Emulsions-PCR
Protokoll
Endvolumen [µl]
Bead Count
Wiedergewinnung
[%]
Beadausbeute
1 LV 696 3.898 8 2.713.008
2 LV 746 3.952 8 2.948.192
3 LV 820 3.048 7 2.499.360
4 LV 800 3.960 9 3.168.000
Ergebnisse
Nach Anreicherung mittels des REM e
Systems wurden die Beads durchflusszytometrisch
gemäß Herstellerangaben gezählt.
Dabei wurde bei allen vier Proben die
gewünschte Anreicherung um 5 % bis 20 %
erzielt (vgl. Tab. 1). Die Beads wurden unter
Einsatz einer in vier Bereiche unterteilten
Picotiterplatte sequenziert.
Sowohl die Sequenzanreicherung (Tab. 1)
als auch die mittleren Leselängen (mit rund
400 Basen) lagen im Zielbereich. Damit
liefert die Automation der Probenvorbereitung
mit Hilfe der Microlab® Starlet Liquid
Handling Workstation qualitativ hochwertige
Sequenzierergebnisse bei signifikanter
Reduktion der Hands-on-Zeit und des Risikos
für Pipettierfehler. Das hier vorgestellte System
ist geeignet für alle Typen von GS FLX-
Titanium-Bibliotheken – wie Shotgun-, Paired
End-, cDNA- und Amplicon-Libraries mit oder
ohne Multiplex Identifiern (MIDs) – sowie für
Emulsions-PCR-Formate mit kleinen, mittleren
und großen Volumina.
Korrespondenzadresse
Bobby Chavli
Hamilton Robotics
4970 Energy Way
Reno, NV 89502 USA
bobby.chavli@hamiltoncompany.com
Marieke Mäder
Hamilton Robotics
Fraunhoferstraße 17
82152 Martinsried
MMaeder@hamiltonrobotics.com
LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 23

Zielgen-Anreicherung Expertenpanel
NGS-basierte Diagnostik
Sequenzierungs-basierte Diagnose-Assays spielen vor allem eine Rolle Diagnostik monogener
Erkrankungen. Mit zunehmender Genauigkeit, aber auch durch den rapiden Kostenverfall beim
Next-Generation Sequencing werden neben der klassischen Sanger-Methode die ultraschnellen
Sequenzer zunehmend interessant für die Diagnostik. Als großer Vorteil erscheint dabei, dass die
bisherige Stufendiagnostik durch die Erfassung multipler Mutationen in einem einzigen Test eingesetzt
werden kann. Da die Maschinen aber bislang alles andere als einfach bedienbar sind, wie
sonstige Diagnostiktest, werden die meisten Tests bislang von hochspezialisierten Dienstleistern
angeboten. Bis die zum Einsatz standardisierter Assays in der klinischen Diagnostik scheint es
indes noch ein weiter Weg.
Saskia Biskup
Dr. Dr. med Saskia
Biskup ist die
Gründerin und
Geschäftsführerin
der CeGaT GmbH
in Tübingen
LABORWELT:
Welche Vorteile bieten Diagnostikpanels auf
Basis des Next-Generation Sequencings und
wie genau müssen sie mindestens sein
Biskup:
Unter einem Diagnostik-Panel versteht
man die gleichzeitige Sequenzierung aller
für eine bestimmte Erkrankung relevanten
Gene. Dies ist deutlich schneller und kostengünstiger
als die herkömmliche Gen-für-
Gen-Sequenzierung. Zudem – und das ist das
Entscheidende – führt die Panel-Diagnostik
aufgrund der parallelen Sequenzierung von
bis zu mehreren hundert Genen signifikant
häufiger zum Auffinden der genetischen Ursache.
Ziel der genetischen Diagnostik ist die
Diagnosesicherung und damit die eindeutige
Zuordnung des Krankheitsbildes. Dadurch
erhalten Patienten Gewissheit, eine Prognoseabschätzung
kann getroffen werden,
und Familienangehörige können beraten und
gegebenenfalls präventiv behandelt werden.
Zudem können Therapien angepasst und
wirkungslose Therapien vermieden werden.
Die Panel-Diagnostik ist eine neu verfügbare
Methode, mit der Veränderungen in den
untersuchten Genen mit hoher Genauigkeit
ausgeschlossen oder identifiziert werden
können. Diese hohe Genauigkeit ist der wichtigste
Vorteil gegenüber der Gesamtgenom-
Sequenzierung. Zudem wird das Auffinden
von Zufallsbefunden, die nicht im Zusammenhang
mit der untersuchten Erkrankung
stehen, praktisch ausgeschlossen. Insgesamt
führen die Diagnostik-Panels zu deutlich
höheren Aufklärungsquoten und stehen
* Dr. Klein arbeitet am Zentrum für Humangenetik und Laboratoriumsmedizin
Dr. Klein, Dr. Rost und Kollegen in Martinsried
als schnelle, effiziente und kostengünstige
Methode für Ratsuchende, Betroffene,
Ärzte und Wissenschaftler weltweit zur
Verfügung.
Hans-Georg
Klein
Dr. med. Hanns-
Georg Klein, Facharzt
für Laboratoriumsmedizin,
Medizinische Genetik,
Martinsried*
LABORWELT:
Welchen Nutzen verspricht eine NGS-basierte
DNA-Analytik in der molekularen Onkologie
und der HLA-Typisierung
Klein:
Das Verständnis der molekularen Mechanismen,
die zur Tumorentstehung und -progression
oder Therapieresistenz führen, sind
wichtig für die Entwicklung neuer Krebsmedikamente.
Mit Beginn der systematischen
Genomforschung vor etwa 20 Jahren konnten
neue Zielstrukturen identifiziert werden, die
individuellere und nebenwirkungsärmere
Therapien möglich machten. Die Charakterisierung
von Mutations- und Aktivierungsmustern
bestimmter Gene identifizierte
„oncogene targets“ und wurde damit zur
Grundlage einer stratifizierten Therapie mit
monoklonalen Antikörpern (mAB) oder „small
molecules“ (z.B. Tyrosinkinaseinhibitoren TKI).
Dieser Ansatz wird unter dem Begriff „personalisierte
Medizin“ zusammengefasst und
heute durch den Einsatz von Hochdurchsatz-
NGS-Geräten nochmals erheblich beflügelt.
Für die Diagnostik relevant ist die Tatsache,
dass bei hämatopoetischen Neoplasien und
soliden Tumoren meist eine Mischung von
Tumorzellen und normalen Zellen vorliegt,
so dass bereits kleinste DNA-Veränderungen
sehr sensitiv erfasst werden müssen. Während
bei der DNA-Sequenzanalyse nach
Sanger die Nachweisgrenze von Minoritäten
bei etwa 20% liegt, können mittels NGS bei
einer entsprechenden Abdeckung bereits 1-5%
mutierte Zellen gegen einen Hintergrund von
95-99% detektiert werden. Bei Leukämien
können beispielsweise Therapieverläufe und
minimale Resterkrankung beobachtet oder
prognostisch ungünstige Mutationen frühzeitig
detektiert werden. Die Sensitivität von
NGS steigert bei soliden Tumoren die Detektionsrate,
insbesondere bei limitiertem Biopsiematerial,
wie es häufig bei der Untersuchung
von Lungentumoren der Fall ist. Ein weiterer
Vorteil von NGS ist, dass in einem gezielten
Amplikon-basierten Ansatz verschiedene
onkogene Targets unterschiedlicher Patienten
parallel, zeitnah und kostengünstig analysiert
werden können.
Die allogene Blutstammzelltransplantation
ist bei Erkrankungen der blutbildenden
Organe oft die einzige kurative Therapiemöglichkeit.
Die Beurteilung der Kompatibilität
zwischen Spender und Empfänger beruht auf
der Bestimmung von HLA-Merkmalen. Diese
liegen im hochvariablen Haupthistokompatibilitätskomplex
(MHC), der über 400 Gene
mit vorwiegend immunologischer Funktion
beinhaltet. Aufgrund der hohen Variabilität
der HLA-Merkmale ist eine eindeutige Bestimmung
der Allele mit herkömmlicher Sequenzierung
nicht immer möglich. Beim NGS-Verfahren
wird eine klonale Sequenzierung des
amplifizierten DNA-Materials durchgeführt,
wodurch eine deutlich bessere Auflösung
der HLA-Allele möglich ist. Gleichzeitig kann
der Probendurchsatz mit sogenannten DNA-
Barcodes (Multiplex Identifiers) auf mehrere
hundert Proben pro Sequenzierlauf erhöht
werden. Bei der Suche nach einem geeigneten
Spender werden derzeit nur einzelne Exons
von vier bis sechs HLA-Genen untersucht.
Trotz vollständiger Übereinstimmung der
untersuchten Merkmale kommt es nach der
Transplantation häufig zu den schweren
Komplikationen Transplantat-gegen-Wirt-
Erkrankung oder Transplantatabstoßung. Das
NGS-Verfahren ermöglicht mit angemessenem
Zeit- und Kostenaufwand die Untersuchung
genetischer Unterschiede auf weitere
potentiell relevante Gene auszuweiten. Somit
können die Spenderauswahl optimiert und
letztendlich bessere Transplantationsergebnisse
erzielt werden.
24 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT

Expertenpanel Zielgen-Anreicherung
Wera Hofmann
Dr. Wera Hofmann,
ist Medical Director
der LifeCodexx AG,
eines Tochterunternehmens
der
Konstanzer GATC
Biotech AG
LABORWELT:
Welche Vorteile und Limitierungen bieten sequenzierungsbasierte
Bluttests im Vergleich
zu invasiven vorgeburtlichen Untersuchungsmethoden
Hoffmann:
Ausgangspunkt des Bluttests ist die Feststellung,
dass die im mütterlichen Blut
zirkulierende zellfreie fetale DNA mittels
NGS-Technologien analysiert werden kann.
Im Unterschied zu invasiven, vorgeburtlichen
Untersuchungsmethoden birgt der Bluttest
kein eingriffsbedingtes Fehlgeburtsrisiko. Bei
negativem Testergebnis bleibt einer großen
Mehrheit schwangerer Frauen mit einem Risiko
für Chromosomenstörungen eine belastende
invasive Untersuchung erspart. In Deutschland
könnten daher jährlich etwa 600 ungeborene
Kinder vor den tödlichen Folgen eines invasiven
Eingriffs bewahrt werden. Während der Bluttest
ab der 12. Schwangerschaftswoche (SSW)
erfolgt, wird eine Fruchtwasseruntersuchung
nicht vor der 14. SSW durchgeführt. Allerdings
ist der Bluttest derzeit auf die Bestimmung
von autosomalen numerischen Chromosomenstörungen
wie der Trisomie 21 begrenzt.
Auch gibt er keinen Aufschluss über die Form
der Trisomie, ob es sich zum Beispiel um eine
freie Trisomie oder eine erblich bedingte
Translokations-Trisomie handelt. Dies kann nur
eine invasive vorgeburtliche Untersuchung klären.
Daher ist schwangeren Frauen mit einem
auffälligen Ergebnis des Bluttests eine invasive
vorgeburtliche Abklärung der genetischen
Ursachen zu empfehlen.
Daniela
Steinberger
Prof. Dr. Daniela
Steinberger, Medizinische
Leitung &
Geschäftsführerin,
bio.logis GmbH,
Frankfurt am Main
LABORWELT:
Wie werden sich durch den Einzug der Next-
Generation-Sequenziergeräte der Markt und
die Erstattung sequenzbasierter Tests auf
Erbkrankheiten verändern
Steinberger:
Ein Ende der rasanten Entwicklung rund um
die DNA-Analysetechnologien ist derzeit
überhaupt noch nicht abzusehen. Wie wir
die anwendbaren Techniken bezeichnen, ob
„next-“ oder „next-next-generation-sequencing“
ist dabei einerlei. Hinter diesen Begriffen,
verbergen sich ohnehin viele verschiedene
Methoden.
Die Methoden, die sich auf dem Markt der
Diagnostik von erblichen Merkmalen und Erkrankungen
durchsetzen werden, sind vermutlich
durch mehrere Attribute gekennzeichnet:
Die Ergebnisse sind günstig zu generieren und
stabil sowie einfach in der Anwendung bei
größtmöglicher Präzision. Allein das macht allerdings
noch keine markt- und erstattungsfähige
Diagnostik daraus. Das Management zur
Nutzbarmachung der vielen günstig und akkurat
produzierten Sequenzen wird dann das
„next-generation“-Ding der Zukunft werden.
Erst damit wird sich der Nutzen individueller
Genome oder Genomteile erschließen und
eine klinische Anwendung möglich. Letzteres
wäre schließlich eine Voraussetzung für die
Erstattung.
Nach „NGS“ lauten die Akronyme und
Schlagworte der Zukunft dann „GIM“ –„genetic
information management“- für den
mit IT-Tools strukturierten Zugang zum
„Interpretom“, zur Gesamtheit der interpretierbaren
DNA-Varianten. Letztlich wird die
Gemeinschaft der Versicherten es sich nicht
leisten können, auf Erkenntnisse genetischer
Diagnostik zu verzichten.
Die Einbindung des Interpretoms in die
elektronische Gesundheitsakte wird dann
ein Punkt im Katalog der zu erstattenden
Leistungen werden.
Forschung
Neuronen mit Licht abschalten
Biophysiker aus Bochum und Berlin haben
den Schaltmechanismus des durch Licht
aktivierbaren Ionenkanals Kanalrhodopsin-2
(ChR2) 3
aufgeklärt. Ihre Ergebnisse präsentieren
die Forscher um Prof. Dr. Klaus Gerwert im
Journal of Biological Chemistry (2012, Bd. 287,
S. 6904). Weil der Ionenkanal die Manipulation
von Nervenzellen allein durch Licht ermöglicht,
hat er sich bereits zum Standardwerkzeug der
Optogenetiker entwickelt. Über die genaue
Funktionsweise des Kanalrhodopsins war
allerdings bislang wenig bekannt. Dies haben
die Bochumer Biophysiker und ihre Partner
von der Humboldt-Universität und der Charité
Berlin jetzt geändert. Ende Februar berichteten
sie über den genauen Schaltmechanismus
des Ionenkanals. Danach löst eine durch Licht
induzierte Veränderung der Aminosäure Glutaminsäure
90 (E90) ein verstärktes Eindringen
von Wassermolekülen in die Zelle aus, so dass
das Protein nun gezielt Ionen durch die Zellmembran
leiten kann. Mittels zeitaufgelöster
Infrarot-Spektroskopie zeigten sie r, dass sich
der Kanal dann öffnet, wenn E90 ein Wasser-
Original und Modell der (ChR2) 3
-Struktur
stoff-Ion abgibt (Deprotonierung). Ergänzend
bestätigten elektrophysiologische Experimente,
dass eine Mutation der Aminosäure zu
einer veränderten Ionendurchlässigkeit des
Membrankanals führt. Am Computer gelang es
den Forschern, zu simulieren, wie die Deprotonierung
den Kanal öffnet und Wassermoleküle
eindringen lässt.
Forschungspolitik
Mehr Geld vom
Bund für Unis
So schnell kann Politik gehen: Am 1.
März empfahlen die sechs Forschungsweisen
der Expertenkommission für
Forschung und Innovation (EFI) Bundesforschungsministerin
Annette Schavan
in ihrem Jahresgutachten, die Unis zu
fördern. Fünf Tage später kündigte die
Ministerin an, das Grundgesetz ändern
zu wollen. Bereits Anfang 2013 soll die Änderung
des §91b, die die Finanzierung von
universitären Einrichtungen durch den
Bund erlaubt, mit Zweidrittel-Mehrheit
beschlossen sein. Seit der Föderalismusreform
2006 sind die Kooperationsmöglichkeiten
zwischen Bund und Ländern
stark eingeschränkt. Das Geld des Bundes
fließt fast ausschließlich in außeruniversitäre
Einrichtungen. Die ländereigenen
Universitäten können derzeit nur zeitlich
befristet über sogenannte Vorhaben,
Geld vom Bund bekommen, zum Beispiel
den Hochschulpakt und die 2017 auslaufende
Exzellenzinitiative.
LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 25

Zielgen-Anreicherung Paperwelt
p53 als Trigger der
Chromothripsis bei Krebs
Rausch T, Jones DT, Zapatka M, Stütz AM, Zichner T, Weischenfeldt J, Jäger N, Remke M, Shih D,
Northcott PA, Pfaff E, Tica J, Wang Q, Massimi L, Witt H, Bender S, Pleier S, Cin H, Hawkins C, Beck C,
von Deimling A, Hans V, Brors B, Eils R, Scheurlen W, Blake J, Benes V, Kulozik AE, Witt O, Martin D,
Zhang C, Porat R, Merino DM, Wasserman J, Jabado N, Fontebasso A, Bullinger L, Rücker FG, Döhner
K, Döhner H, Koster J, Molenaar JJ, Versteeg R, Kool M, Tabori U, Malkin D, Korshunov A, Taylor
MD, Lichter P, Pfister SM, Korbel JO. (2012): Genome Sequencing of Pediatric Medulloblastoma
Links Catastrophic DNA Rearrangements with TP53 Mutations. Cell, doi: 10.1016/j.cell.2011.12.013
Erst seit Kurzem ist bekannt, dass Krebs durch explosionsartig in einem einzigen Schritt auftretende
chromosomale Umlagerungen entstehen kann. Was allerdings hinter dem Chromothripsis genannten
Phänomen steckt, lag bislang im Dunkeln. Korbel und Kollegen haben bei der Sequenzanalyse
des Genoms von Patienten mit Sonic Hedgehog-Medulloblastom nun erstmals zeigen können, dass
eine Mutation im Tumorsuppressorprotein p53 stark mit der Chromothripsis korreliert. In dieser
Tumorart tritt der neue Krebsmechanismus bei 30% der Patienten auf. Nun soll untersucht werden,
ob und in welchen Tumorarten der neuentdeckte Mechanismus eine Rolle spielt.
LABORWELT:
Was sind Ihre wichtigsten Ergebnisse
Korbel:
Vor rund einem Jahr beschrieb die Arbeitsgruppe
um Peter Campbell im britischen
Cambridge einen neuartigen Mechanismus
der Krebsentstehung namens „Chromothripsis“.
Dabei kommt es zu einer geradezu explosionsartigen
Umlagerung großer Teile des Erbguts
einer zuvor gesunden Zelle – Ergebnis ist die
Entwicklung von Krebs. Nach Erscheinen der
Studie von Campbell blieb jedoch unklar, welche
zellulären Mechanismen Chromothripsis bewirken,
oder ob es genetische Prädispositionen
für sie gibt. Unsere Forschung hat in diesem
Zusammenhang zu sehr interessanten, neuen
Erkenntnissen geführt. Bei kindlichen Hirntumoren
fanden wir, dass eine Mutation im Gen
für das Protein p53 Chromothripsis auslöst. p53
wird auch „Wächter des Genoms“ genannt,
denn das Protein sorgt normalerweise dafür,
dass gesunde Zellen bei Erbgutschäden die
Zellteilung einstellen – Krebs kann nicht mehr
entstehen. Wir vermuten, dass p53-Mutationen
diesen Schutzmechanismus ausschalten, so
dass es zur Chromothripsis und Krebsentstehung
kommen kann. Allerdings ist auch denkbar,
dass p53-Mutationen die explosionsartigen
Umlagerungen direkt auslösen.
LABORWELT:
Was war der Ausgangspunkt Ihrer Forschung
Korbel:
Vor einigen Jahren stellte ein Kollege von uns –
Andreas Kulozik, leitender Arzt an der Heidelberger
Universitäts-Kinderklinik – bei einem kleinen
Mädchen, dass an einem Sonic Hedgehog- (SHH)
Medullo blastom erkrankt war, eine erbliche
Veränderung im p53-Gen fest. Im Rahmen des
Internationalen Krebsgenom-Konsortiums
(ICGC, www.icgc.org) ist meine Arbeitsgruppe an
der molekularen Aufklärung der Entstehung von
Medulloblastomen beteiligt. Als wir, gemeinsam
mit Wissenschaftlern um Peter Lichter und Stefan
Pfister vom Deutschen Krebsforschungszentrum,
begannen, am EMBL die weltweit ersten
vollständigen Genomsequenzen von kindlichen
Tumoren zu erzeugen, erschien uns der Fall des
Heidelberger Mädchens als ein vielversprechender
Ansatzpunkt. Bei der Analyse ihres Genoms
trauten wir zuerst unseren Augen nicht: Wir
sahen Muster im Genom, die auf explosionsartige
Umlagerungen hindeuteten, wie sie
vorher noch nicht in Hirntumoren beschrieben
worden waren. Schnell wurde uns klar, dass wir
neue Einblicke in die Krebsentstehung durch
Chromothripsis gewonnen hatten.
LABORWELT:
Wie sind Sie experimentell vorgegangen
Korbel:
Im Anschluss an die Analyse des Erbguts des
Mädchens unterzogen wir Tumorproben von
98 Medulloblastomen einer Erbgutanalyse. In
13 der 98 Proben entdeckten wir das für Chromothripsis
typische Chromosomen-Chaos. In
allen 13 Tumoren fand sich ein verändertes p53
Gen, während wir bei Patienten mit normalem
p53 nicht explosionsartige Veränderungen
festgestellt haben.
LABORWELT:
Wo liegen die biologische Relevanz Ihrer
Ergebnisse oder mögliche Anwendungen
Korbel:
Wir prüfen derzeit, ob wir künftig bei allen
Patienten mit SHH-Medulloblastomen nach
erblichen p53-Mutationen suchen sollen. Liegt
Dr. Jan Korbel
Dr. Jan Korbel ist als Gruppenleiter innerhalb
der Abteilung Genome Biology des
EMBL in Heidelberg tätig. Der Spezialist für
genomische Strukturvariationen promovierte
2005 – nach Studium der Biotechnologie
an der TU Berlin – an der HU Berlin
und am EMBL in Heidelberg. Als Post-Doc
forschte Korbel in Dr. Mark Gersteins Labor
an der Yale University in New Haven. 2008
kehrte er zurück ans EMBL. Der Genomicsund
Bioinformatikexperte arbeitet in internationalen
Großprojekten mit, wie dem
1000 Genomes-Projekt oder dem Internationalen
Cancer Genome Consortium.
eine solche Mutation vor, so haben die Betroffenen
ein erheblich erhöhtes Krebsrisiko – ohne
davon zu wissen. Entdecken wir einen erblichen
p53-Defekt, so können wir engmaschige
Früherkennungsuntersuchungen empfehlen,
um mögliche Tumoren in einem besser behandelbaren
Stadium zu entdecken und so die
Heilungschancen signifikant zu verbessern.
Ein weiterer Grund spricht dafür, bei Patienten
mit SHH-Medulloblastomen nach erblichen
p53-Mutationen zu fahnden: Liegt eine solche
Mutation vor, so ist besondere Vorsicht bei der
Wahl der Behandlungsmethoden geboten, denn
Strahlentherapie und auch einige Zyto statika
wirken, indem sie das Erbgut schädigen. Bei
Menschen mit vererbtem p53-Defekt ist die
DNA-Reparatur jedoch in allen Körperzellen
beeinträchtigt, so dass therapiebedingte DNA-
Schädigungen leicht zu weiteren Tumoren
führen könnten.
LABORWELT:
Wie gehen Ihre Arbeiten jetzt weiter
Korbel:
Wir werden auch in anderen Krebsarten nach
Merkmalen von Chromothripsis suchen, mit
dem Ziel, weitere genetische Faktoren zu erkennen,
die bei diesem Phänomen eine Rolle spielen.
Chromothripsis führt zu ausgesprochen aggressiven
Tumoren, deshalb halten wir es für sehr
wichtig, den molekularen Mechanismus vollständig
aufzuklären. Wir erhoffen, dadurch den
Weg für bessere diagnostische Verfahren oder
neue Krebstherapieformen frei zu machen.
26 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT

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zum Thema Life Sciences

III
Zellbiologie Zellkultur
Zellbiologie
Schnelle Kulturtechnik
zur Detektion mikrobieller
Kontaminationen
Bret Barnhizer, CEO, NanoLogix Inc., Hubbard, USA
Zellbasierte Verfahren haben einen wahren
Aufschwung sowohl beim Drug Screening,
der Toxizitätstestung von Chemikalien als
auch dem Nachweis von Keimen erlebt.
Zwar ist die Aussagekraft der zellbiologischen
in vitro-Tests naturgemäß begrenzt.
Doch durch zunehmende Datenintegration
und Simulation soll langfristig die Modellierung
auch komplexer Vorgänge möglich
werden.
Von Tierersatz bis Zellkultivierung
Die Fortschritte die die in vitro-Assays
bei der Substanztestung gemacht haben,
beleuchten Jürgen Hescheler, Thomas
Hartung und Dirk Dressler in einem Expertenpanel
„Toxizitätstestung“ (vgl. Seite 35).
Die Fortschritte bei einfachen Endpunkten
wie der akuten Toxizität dürfen indes nicht
darüber hinwegtäuschen, dass die Zahl
der Tierversuche in den nächsten Jahre
weiter drastisch steigen wird, weil sich
systemische und Langzeitwirkungen bis
auf absehbare Zeit eben nur in Modelltieren
untersuchen lassen.
Über deutliche Fortschritte im Bereich
der Qualitätssicherung können sich indes
biopharmazeutische Firmen und Lohnhersteller
freuen. Die US-Firma Nanologix
(vgl. S. 28) hat nämlich ein Verfahren zum
Kulturnachweis von mikrobiellen Kontaminanten
entwickelt, das die Kultivierungszeit
dank einer Nanoporenmembran um
Faktor 1o verkürzt. Die Technik, die sich
im FDA-Zulassungsverfahren befindet,
könnte auch den Milliardenmarkt der klinischen
Diagnostik aufmischen. Auf einen
verbesserten Nachweis von Erregern zielt
auch ein neues durchflusszytometrisches
Verfahren ab (vgl. S. 30), das derzeit von
einem Forschungsverbund aus Münster
entwickelt wird.
Wie Impfstoffentwickler mit neuen
intranasalen Impfstoffverstärkern die
gewünschte Immun antwort künftig
auswählen können, haben Forscher des
Helmholtz-Zentrums für Infektionsforschung
herausgefunden (vgl. S. 32).
Im Sommer 2001 hat die US-Gesundheitsbehörde FDA ihren strategischen Plan „Advancement
of Regulatory Science“veröffentlicht 1 . In diesem unterstreicht die Agentur vier Gebiete, in denen
das Risiko für mikrobielle Kontamination in diversen produzierenden Industrien reduziert
werden soll; eines davon ist die Reduktion des Risikos mikrobieller Verunreinigungen durch
die Entwicklung „sensitiver, schneller Hochdurchsatz-Verfahren, um mikrobielle Kontaminationen
zu detektieren, identifizieren und beziffern sowie ihren Nutzen bei der Einschätzung
der Produktsterilität zu validieren“. Für die pharmazeutische Industrie heißt dies, die für die
mikrobielle Qualitätssicherung (QA) und -Kontrolle (QC) benötigte Zeit zu verkürzen – sowohl
bei der Reinraum-Validierung, der in-Prozess-Kontrolle als auch bei der finalen sterilen
Produktformulierung. Eine neue von NanoLogix entwickelte Technologie bietet eine Lösung:
Durch eine signifikante Verbesserung der zuverlässigen Kulturmethoden in Petrischalen wird
das mikrobielle Wachstum schnell erkannt. Die neue, auf Nanoporen-Membranen basierende
Methode verringert die Zeit, um mikrobielle Kontaminationen zu erkennen auf allen Stufen des
pharmazeutischen Produktionsprozesses. Durch die NanoLogix-Technologie verkürzt sich die
Zeit des Kulturnachweises zum Beispiel von Listeria spp und E. coli von 18 bis 24 Stunden auf nur
5 Stunden. Salmonellenwachstum kann sogar schon nach vier Stunden beobachtet werden.
Abb. 1: Entfernen einer BNP-Membran vom Nähragar
Die Verifikation steriler Bedingungen während
des Produktsprozesses – ob durch aseptisches
Prozessing oder Sterilisation – ist oft nach wichtigen
Schritten erforderlich, wie dem Ansetzen
von Lösungen, dem Bulk Transfer, Abfüllen
der Ampullen etc. Wenn multiple Haltezeiten
für die in-Prozess mikrobiologische Testung
benötigt werden, kann dies den Produktionsprozess
um Tage verlängern, was den effizienten
Einsatz von Ausrüstung und Personal
erschwert. Zwar können für die in-Prozess mikrobiologische
Testung alternative Verfahren
wie PCR und Durchflusszytometrie eingesetzt
werden, die schneller sind als die Kultivierung.
Aber sie sind nicht imstande, auch nur annähernd
brauch- und belastbare Ergebnisse zu
liefern. Dazu kommt, dass allein PCR-Tests eine
18-Stunden-Übernacht-Anreicherung benöti-
28 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT

Zellkultur Zellbiologie
gen können. Das mag kurz erscheinen. Doch
haben solche in-Prozess-Haltezeiten ernste
Folgen für die pharmazeutische Industrie. Denn
während des Produktionsprozesses werden
solche Tests zu verschiedensten Zeiten auf der
Stufe des Processings durchgeführt, und die
Haltezeiten summieren sich und verlängern die
Produktionszeit bis zum Endprodukt. Firmen
können durch verlängerte Produktionszeiten
an Wettbewerbsfähigkeit einbüßen, da eine
kosteneffiziente Logistikkette essentiell für
die Industrie ist.
Mangel an Alternativen zur Kultur
Da es nicht möglich ist, das Wachstum der
Mikroorganismen zu beschleunigen, suchen
pharmazeutische Unternehmen nach Verfahren,
die schneller Ergebnisse liefern als die
traditionellen mikrobiologischen Kulturmethoden.
Die Poymerase-Kettenreaktion (PCR)
liefert Ergebnisse binnen Minuten, allerdings
erst nachdem die Assays einen 18-stündigen
Anreicherungsprozess über Nacht durchlaufen
haben. Dazu kommmt, dass ein PCR-Screening
nur die Anwesenheit von DNA detektieren
kann, dagegen nicht verwertbare Informationen
über bakterielles Wachstum. Zudem
sind nach der PCR in der Regel weitere PCRoder
Kultur-basierte Verifikationsschritte
notwendig, um festzustellen, ob den Prozess
gefährdende Mikroorganismen präsent sind.
Der Hauptnachteil der Durchflusszytometrie
ist ihre geringe Durchsatzrate, was die effiziente
Handhabung einer großen Probenanzahl
ausschließt.
Eine einfache schnellere Methode
zur Kultivierung
NanoLogix‘ fortgeschrittene Kulturtechnologie
erfüllt die Forderung der FDA nach einem
sensitiven Schnelltest. Die Methode liefert
belastbare Kultivierungsdaten vier- bis 24mal
schneller als die konventionelle Kultivierung,
abhängig von Bakterium und genutztem
Produkt. Die Technologie ermöglicht es QA/QS-
Technikern, das Wachstum von Mikrokolonien
wesentlich schneller zu sehen und diese zu
identifizieren als mit traditioneller Petrischalen-Kultur,
PCR oder Durchflusszytometrie.
Obgleich das Verfahren derzeit nur in zwei
Standard-Petrischalengrößen zur Verfügung
steht, ist es grundsätzlich möglich, die Technologie
in Well plate-Arrays für das Hochdurchsatz-Screening
zu überführen.
Das Funktionsprinzip
Herzstück der BioNanoPore (BNP)-Methode
von NanoLogix ist eine permeable Polymermembran,
die sich zwischen zwei Agarschichten
befindet. Die extrem dünne, durchsichtige
Abb. 3: Prinzip der BFN-Technologie von NanoLogix
Membran gestattet es den Mikroorganismen,
für einige Stunden zu wachsen. Dann, nach
einem Bruchteil der herkömmlichen Inkubationszeit,
wird die Membran auf eine Färbeplatte
transferiert. Kapillarkräfte transportieren das
Färbemittel – eine HRP-konjugierte Antikörper-
Lösung – durch die Membran und bringen es in
Kontakt mit den Mikrokolonien. Nach 10 bis 15
Minuten Färbezeit können die Mikrokolonien
detektiert und identifiziert werden.
Bei der Testung eines parenteralen Produktes,
ergab sich nach Filtration der „sterilen“ Lösung
mit der BioNanoFilter (BFN)-Technologie
eine Nachweissensitivität von einer Zelle pro
Liter bei einer Nachweiszeit von vier bis sechs
Stunden.
Damit hat die NanoLogix-Technologie das
Potential, Produktionszeiten durch Verkürzung
von in-Prozess-Haltezeiten zu reduzieren.
Das Verfahren lässt sich auf jeder Stufe des
Produktionsprozesses kosteneffizient, verlässlich
und mit angemessenem Durchsatz
implementieren. Diverse Wissenschaftler,
betrachten die Nanologix-Technology bereits
als ‘neuen Goldstandard’ im Gebiet der
Schnelldiagnostik 2 .
Literatur
[1] Pharma QBD. FDA Releases Strategic Plan for Advancement
of Regulatory Science, August 18, 2011. http://
www.pharmaqbd.com/fda_strategic_plan_regulatory_science/
[2] Jonathan Faro, Allan Katz, Karen Bishop, Gerald Riddle,
Sebastian Faro. “Rapid Diagnostic Test for Identifying
Group B Streptococcus. American Journal of Perinatology.
Thieme eJournals, August, 2011.
Korrespondenzadresse
Bret Barnhizer, CEO
NanoLogix, Inc.
843 North Main Street
Hubbard, OH 44425 USA
Tel.: +1-(0)330-534-0800
Fax: +1-330-534-0826
LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 29

Zellbiologie Durchflusszytometrie
READYFlow – Lange
Leuchtdauern für schnelle
Flow Cytometry-Analysen
Dr. Peter Klauth, Hochschule Niederrhein, Krefeld; Dr. Wolfgang Göhde, Quantum Analysis
GmbH, Münster; Martin Gründkemeyer, Technologieförderung Münster GmbH,
Münster (Westfalen)
Durchflusszytometer (Flow Cytometer, FCM) erlauben einen schnellen Nachweis und die Analyse
von biologischen Zellen und anderen mikroskopischen und submikroskopischen Partikeln, die mit
hoher Geschwindigkeit an einem Lichtstrahl vorbeifließen. Das 1968 entwickelte Messprinzip der
fluoreszenzbasierten Durchflusszytometrie wurde anfangs für die Untersuchung eukaryotischer
Zellen und ihrer Zellteilung verwendet. Durch international immer weiter entwickelte biochemische
Verfahren und eine zunehmend einfachere Handhabung wird das Messverfahren inzwischen auf
zahlreichen Gebieten eingesetzt: Medizinische und zellbiologische Grundlagenforschung, Routinediagnostik
in Kliniken, Nanopartikel-Analysen und mikrobiologische Prozessüberwachung in der
Lebensmittelproduktion sind nur einige Beispiele hierfür. Durch einen neuen Ansatz auf der Basis von
biochemischen Sonden mit langer Leuchtdauer sollen nun die Präzision und Anwendungsmöglichkeiten
im Rahmen eines vom BMWi geförderten Forschungsprojekts deutlich erweitert werden.
Abb. 2: Differenziertes Anfärben von Zellen.
Autofluoreszenz (weiße Sterne) kann
die Fluoreszenz der spezifischen Farbstoffsonden
(mit grünen und orangen
Sternen) störend überlagern.
Nach Messzeiten von wenigen Sekunden bei
bis über 10.000 Zellen/Sek. können so Proben
mit hoher statistischer Sicherheit analysiert
werden.
Präziser Nachweis von Bakterien –
neue Farbstoffklassen für FCM
Die Durchflusszytometrie ist ein Verfahren
zur schnellen automatisierten Analyse der
optischen Eigenschaften einzelner Partikel
oder Zellen. Eine Probensuspension strömt
durch eine hochpräzise optische Küvette
(vgl. Abb. 1). Dabei wird der Probenfluss so
fokussiert, dass die Zellen einzeln und nacheinander
den Messbereich passieren. Zuvor
in einem Präparationsschritt biochemisch
an Zelloberflächen gekoppelte spezifische
Leuchtsonden (Marker) werden durch einen
Lichtstrahl angeregt. Mit Fluoreszenzfarbstoffen
gekoppelte monoklonale Antikörper
sind in der FCM weit verbreitete Sonden, mit
denen Zellen anhand ihrer spezifischen Zell-
Oberflächen-Antigene erkannt und voneinander
unterschieden werden können.
Für jede Zelle werden Streu- und Fluoreszenzsignale
von optischen Detektoren
aufgenommen und mit schnellen Computerprogrammen
ausgewertet und gezählt.
In den gesammelten Daten lassen sich unterschiedliche
Gruppen von Zellen voneinander
differenzieren und ihre Zellzahl bestimmen.
In der Durchflusszytometrie können gleichzeitig
mehrere Fluoreszenzfarbstoffe mit unterschiedlichen
Emissionsspektren analysiert
werden. Dafür werden in mehreren optischen
Spektralbereichen (z.B. im Grünen und Orangen)
Fluoreszenzintensitäten analysiert. Mehrere
Zellgruppen lassen sich dadurch in einer Messung
voneinander unterscheiden (vgl. Abb. 2).
Bei dem Nachweis von Bakterien sollen
möglichst kleine Zellzahlen schnell und sicher
nachgewiesen werden. Häufig wird aber ein
präziser und schneller Nachweis kleiner Zellzahlen
gerade bei Mikroorganismen dadurch
erschwert, dass die Lichtsignale der Fluoreszenzsonden
durch eine natürliche Fluoreszenz
(Autofluoreszenz) anderer Substanzen in
der Probe oder in der Zelle störend überlagert
werden. Eine sichere Interpretation der Messergebnisse
ist dann oft mit hohem Aufwand
verbunden oder sogar unmöglich.
Dieses Problem soll durch einen neuen
Ansatz auf Basis von für die FCM neuen
Farbstoffklassen und auf Grundlage zeitlicher
Auflösung der Lichtsignale gelöst werden.
Eine neuartige Kombination von lang leuchtenden
Farbstoffsonden und angepasster
Messgeometrie soll „saubere“ Messdaten
liefern und damit das Einsatzspektrum von
Flow Cytometern signifikant erweitern.
Zeitaufgelöstes Messen
für präzise Analysen
Abb. 1: Messprinzip der Durchflusszytometrie. Lichtsignale (Streulicht/side/forwardscatter
und Fluoreszenz/fluorescence) einzelner Zellen in einer Probensuspension werden
durch eine Lichtquelle (Laser oder LED) angeregt, einzeln registriert und analysiert.
Die spektrale Differenzierung von verschiedenen
Farbstoffen in der Durchflusszytrometrie
ist Stand der Technik. Jedoch ist
dieses Verfahren wegen störender spektraler
30 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT

Durchflusszytometrie Zellbiologie
Überlappungen limitiert: Erstens durch die
Autofluoreszenz und zweitens wegen mehrerer
Zielfarbstoffe untereinander, so dass
eine präzise Unterscheidung in bestimmten
Fällen nicht möglich ist. Um dieses Problem
zu umgehen, sollen anstelle der üblichen
Fluoreszenzsonden nun Phosphoreszenzmarker
mit sogenannten Selten-Erd-Farbstoffen
eingesetzt werden. Durch diese Leuchtstoffe
lässt sich eine Emissionsstrahlung erzeugen,
deren Dauer im Bereich von Millisekunden die
der Autofluoreszenz um typischerweise mehr
als das 1.000-fache übersteigt.
Das Prinzip ist unter anderem auch bekannt
bei der Phosphoreszenz von Ziffernblättern
in Armbanduhren – diese leuchten
noch länger nach. Das gesamte Leuchtsignal
jedes Partikels (Total Luminescence, vgl. Abb.
3) wird erst nach Abklingen der störenden
Autofluoreszenz (Autofluorescence) aufgenommen,
was eine Analyse ohne störende
Hintergrundemissionen ermöglicht. Durch
die Erweiterung der Messergebnisse um
die Dimension Zeit ist bei diesem Vorgehen
eine deutlich höhere Sensitivität gegenüber
bestehenden Verfahren und eine einfachere
Auswertung der eigentlich komplexen Datenausgabe
eines Durchflusszytometers zu
erwarten.
Eine weitergehende Analyse basiert auf der
für verschiedene Farbstoffe charakteristischen
Abklingkurve. Wenn sich die überlagernden
Phosphoreszenz-Abklingzeiten der Farbstoffe
(Abb. 3 Phosphorescence 1 & 2) ausreichend
voneinander unterscheiden, können ihre
Daten aus einer zeitaufgelösten Analyse der
Abklingkurve (z.B. durch multi-exponentiellen
Fit) voneinander separiert werden.
Bisher können Phosphoreszenzmarker in
der Flow Cytometry nicht genutzt werden, da
die lange Abklingzeit zum üblichen Messprinzip
konträr ist. Lichtsignale von Zellen lassen
sich üblicherweise nur in einem sehr kurzen
Messfenster von wenigen Mikrosekunden
detektieren, in dem sie sich im Fokus des
Lasers befinden. Das „Nachleuchten“ über
Millisekunden kann in bestehenden Geräten
systembedingt nicht aufgenommen werden.
Die Zellen oder Partikel verweilen dafür
zu kurz im Messbereich. Es gibt wohl einige
Ansätze für zeitaufgelöstes Messen, zum
Beispiel durch zwei hintereinander geschaltete
Messfenster 1 . Dieser Ansatz ist jedoch
auch zeitlich sehr eingeschränkt und bisher
nicht zur praktischen Anwendung gekommen.
Ein Durchflusszytometer, das Abklingkurven
solch lang leuchtender Phosphoreszenzmarker
analysieren kann, benötigt eine
spezielle, der Anregungsstelle nachgelagerte
Messstrecke, die derzeit in keinem am Markt
befindlichen Gerät vorhanden ist. Die Idee ist
nun, durch eine optische Nachführung mit
einem Kippspiegel das Phosphoreszenzsignal
über einen längeren Zeitraum zu sammeln
und zu detektieren (vgl. Abb. 4).
Dabei soll der Fokus durch optische Zeilensensoren
und einen Kippspiegel, ähnlich
denen in DLP-Projektoren, nachgeführt
werden. Durch die deutlich verlängerte Messstrecke
wird eine Zelle während der gesamten
Abklingzeit verfolgt und eine Abklingkurve
aufgenommen.
Forschungsprojekt READYFlow
Quantum Analysis entwickelt und produziert
portable Durchflusszytomenter. Das iNano Institut
der Hochschule Niederrhein hat sich auf
die Verwendung von Selten-Erd-Farbstoffen
in umweltanalytischen Diagnoseverfahren
spezialisiert. Das iNano hat ein für die Anwendung
geeignetes Messverfahren zum Patent
angemeldet und stellt sein diesbezügliches
Know-how zur Verfügung. Gemeinsam mit
der Fachhochschule Münster, welche seit
vielen Jahren Phosphoreszenzfarbstoffe und
-marker erforscht, wurden bereits zahlreiche
Leuchtstoffsonden entwickelt.
READYFlow soll als innovatives Verfahren
der Durchlusszytometrie im Rahmen einer
vom BMWi geförderten Zusammenarbeit
innerhalb der nächsten zwei Jahre erforscht
Abb. 4: READYFlow-Kippspiegel-Prinzip:
Einzelne Zellen bzw. ihr Lichtsignal
werden nach Durchlaufen des Anregungslasers
mithilfe einer Kombination
aus optischem Zeilendetektor
und Kippspiegel während der
Leuchtdauer verfolgt.
und zur Marktreife entwickelt werden. Dabei
werden sowohl eine neue Gerätekomponente
als auch passende Selten-Erd-Farbstoffe
entwickelt. Neue Farbstoffsonden werden
für die neue Gerätekomponente und Schlüsselanwendungen
„maßgeschneidert“. Das
neue Produkt soll präzise, mobil, einfach zu
bedienen und preiswert sein, um eine tiefe
Durchdringung im Diagnostik- und Analysemarkt
zu ermöglichen. Einsatzorte wären
zum Beispiel der schnelle Nachweis von MRSA
(Multi-resistenter Staphylococcus aureus)
während der Patientenaufnahme im Krankenhaus
oder die Analyse von Blutproben in
einer Facharztpraxis. Derzeitige Durchflusszytometer
sind in beiden Fällen zu teuer und arbeitsintensiv
in der Dateninterpretation. Die
2011 aufgetretene Welle an EHEC-Infektionen
(Enterohämorrhagische Escherichia Coli) zeigt
die Notwendigkeit mobiler, preiswerter und
vor allem schneller Testsysteme.
Korrespondenzadresse
Martin Gründkemeyer
Netzwerk Oberfläche NRW
Technologieförderung Münster GmbH
Mendelstraße 11
D-48149 Münster
Tel.: +49-(0)251 980–1125
Fax: +49-(0)251 980-31125
gruendkemeyer@technologiefoerderungmuenster.de
www.technologiefoerderung-muenster.de
Abb. 3: Prinzip der innovativen FCM-Phosphoreszenz-Analyse (schematisch, unterschiedliche
vertikale Skalierungen). Die Lumineszenz-Abklingkurve wird erst nach Abklingen des
Autofluoreszenzsignals (außerhalb des schattierten Bereichs) aufgenommen.
www.laborwelt.de
LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 31

Zellbiologie Paperwelt
Adjuvantien-Toolbox für
die gezielte Steuerung
der Immunantwort
Zygmunt BM, Weissmann SF, Guzman CA. (2012): NKT Cell Stimulation with alpha-Galactosylceramide
Results in a Block of T H
17 Differentiation after Intranasal Immunization in Mice,
PLoS One. 2012;7(1):e30382
Die intranasale Verabreichung von modernen Subunit-Impfstoffen gegen Infektionserreger
gilt als sehr aussichtsreich, stellt die Forscher aber auch vor einige Schwierigkeiten.
So müssen die Impfstoffe aufgrund der geringen Aktivierung von Immunantworten mit
einem Immunstoffverstärker versetzt werden. Ein weiteres Problem war bislang, dass
die intranasale Impfung stets von der Aktivierung einer sogenannten T H
17-vermittelten
Immunantwort begleitet wurde. Die dadurch ausgelöste, teils überschießende Immunantwort
kann bei vielen Impfungen eher hinderlich als erwünscht sein. Die Gruppe um
Carlos Guzmán vom Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung in Braunschweig hat jetzt
den Mechanismus aufgeklärt, mit dem ein spezieller Impfstoffverstärker, das pegylierte
a-Galactosyl-Ceramid (a-GalCerPEG) die T H
17-vermittelte Immunantwort selektiv abschaltet.
a-GalCerPEG hemmt die Induktion von T H
17-Zellen , indem es NKT-Zellen dazu bringt,
die Botenstoffe Interferon-g (IFNg) und vor allem Interleukin-4 (IL-4) auszuschütten. Die
Kombination a-GalCerPEG mit anderen Adjuvantien bei der intranasalen Impfung bietet
somit erstmals die Möglichkeit zu steuern, welche Art von Immunantwort bei der Impfung
gefördert wird – die T H
2-vermittelte Antikörperbildung gegen extrazelluläre Erreger oder
die T H
1-vermittelte Abwehr durch Killerzellen bei intrazellulären Erregern. Das gezielte
Zu- oder Abschalten der T H
17-unterstützten Immunantwort würde Impfstoffherstellern
die Gelegenheit bieten, Impfstoffe mittels einer Adjuvantien-Toolbox für die jeweilige
klinische Anwendung maßzuschneidern.
Carlos A. Guzmán
Carlos A. Guzmán leitet die Abteilung
„Vakzinologie und Angewandte Mikrobiologie“
am Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung
(HZI) in Braunschweig. Der
Mediziner ist APL-Professor an der Medizinischen
Hochschule Hannover und Gast-
Dozent für die Promovierenden der Fachrichtung
Biotechnologie an der Universität
von Catania (Italien). Nach dem Studium
der Medizin an der Nationalen Universität
Rosario (1981) und Facharztabschluss in
medizinischer Bakteriologie (1986) in Argentinien
sowie Promotion zum MD und
PhD in Italien übernahm Guzmán 1994 die
Leitung der Forschungsgruppe Vakzinologie
an der Gesellschaft für Biotechnogische
Forschung (GBF) in Braunschweig.
2005 wurde er zum Leiter der neuen Abteilung
Vakzinologie am HZI.
LABORWELT:
Was sind ihre wichtigsten Ergebnisse
Guzmán:
Wir haben einen über die Nase verabreichbaren
Impfstoffverstärker entwickelt, der eine
maßgeschneiderte Immunisierung gegen
bestimmte Erreger ermöglicht. Grundsätzlich
wird bei intranasalen Impfstoffen eine
sogenannte T H
17-unterstützte Immunreaktion
hervorgerufen. Dies ist meistens
erwünscht, da sie die Immunreaktion gegen
Bakterien fördert, kann aber auch zu unerwünschten
Entzündungsreaktionen führen.
Deshalb ist es wichtig die Stimulierung der
T H
17-Zellen regulieren zu können, damit es
keine unerwünschten Nebenwirkungen gibt.
Uns ist es nun gelungen den Mechanismus
aufzuzeigen, mit dem a-GalCerPEG die T H
17-
vermittelte Immunantwort ausschaltet und
zugleich in Impfstoffformulierungen die
Produktion von Antikörpern und Killerzellen
stimuliert. Setzt man a-GalCerPEG darüber
hinaus zusammen mit anderen Adjuvantien
ein, die die von T H
2-Zellen unterstützte Bildung
von Antikörpern gegen extrazelluläre
Erreger oder die von T H
1-Zellen vermittelte
Aktivierung von Killer- Zellen (CTL) gegen
intrazelluläre Pathogene fördern, lässt sich
die Immunantwort maßschneidern, indem
die T H
17-Komponente zu- oder abgeschaltet
wird. Auf diese Weise erhalten wir eine Toolbox,
die den Einsatz des optimal für einen
klinischen Zweck geeigneten Impfstoffverstärkers
ermöglicht.
LABORWELT:
Wo liegt die biologische und medizinische
Relevanz Ihrer Arbeit
Guzmán:
Die meisten Adjuvantien basieren im Moment
auf Aluminiumsalzen, und es gibt zur Zeit
nicht viele Alternativen – schon gar keine, die
eine gezielte Steuerung der Immunantwort
gestatten. Dazu kommt: Fast alle Adjuvantien,
die wir haben, sind auf Parenteralimpfstoffe
ausgelegt, welche man spritzen muss. Das ist
in bestimmten Ländern, wo Kreuzkontaminationen
auftreten können, ein Problem. Bislang
gibt es kein zugelassenes Adjuvans, das gut
über die Schleimhaut funktioniert und so für
viele Zwecke nützlich wäre. Ein Adjuvans allein
nutzt natürlich nichts. Wir testen und validieren
daher das a-GalCerPEG mit Partnern
in verschiedenen Impfstoffformulierungen,
vor allem gegen virale Humanpathogene.
Zudem haben wir in präklinischen Versuchen
gesehen, dass a-GalCerPEG helfen kann,
die nachlassende Immunantwort im Alter
(Immuns eneszenz), zu verbessern. Das ist klinisch
bedeutend, da Impfungen nur bei einem
kleinen Teil der älteren Bevölkerung wirken,
da bei diesen die Immunreaktion nicht mehr
so ausgeprägt ist wie bei den Jüngeren. Dies
erforschen wir aktuell im BMBF-geförderten
Projekt GERONTOSHIELD.
LABORWELT:
Wie geht Ihre interessante Forschungsarbeit
nun weiter
Guzmán:
Hinsichtlich möglicher Anwendungen von
a-GalCerPEG in Impfstoffen treiben wir die
Zusammenarbeit mit Industrieunternehmen
und akademischen Gruppen voran. Zudem
forschen wir weiter an der Aktivierung des
Immunsystems älterer Menschen. Schließlich
wollen wir den Wirkmechanismus des
neuen Adjuvans noch detaillierter verstehen.
Bisher wissen wir, dass die T H
17-Hemmung
über Natürliche Killer-T-Zellen (NKT-Zellen)
vermittelt wird. Wir sehen eine Stimulierung
von NKT-Zellen, die bestimmte Zytokine
ausschütten. Diese Zytokine sind kritisch, um
ein bestimmtes Milieu im Rahmen der Antigenpräsentation
zu erzeugen; so verhindern
beispielsweise IL-4 und IFNg die Bildung von
T H
17-Zellen.
32 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT

Imaging Zellbiologie
Zellteilungsdauer im
High-Content-Screening
bestimmen
Dr. Andreas Pippow 1 , Stefan Borbe 1 , Sebastian Räse 2 , Dr. Stefan Prechtl 2 ,
Prof. Dr. Thomas Berlage 1 ; 1 Fraunhofer-Institut für Angewandte Informationstechnik
FIT, Schloss Birlinghoven, Sankt Augustin; 2 Bayer Healthcare Pharmaceuticals,
Global Candidate Generation & Exploration Screening, High Content Analysis
Bei der Entwicklung neuer Wirkstoffe für die Krebstherapie sind bildgebende Verfahren
nicht mehr wegzudenken. Eines dieser Verfahren ist das High-Content-Screening. Dabei
kann man herausfinden, ob bestimmte Substanzen die Teilung von Krebszellen und damit
das Wachstum von Tumoren verringern oder sogar verhindern. Automatisierte Mikroskope
generieren bei der Aufnahme sich teilender Zellen riesige Datenmengen, die in zeitaufwändigen
Prozessen analysiert werden müssen. Die Etablierung dieser Experimente und die
Auswertung der Bilddaten dauert dabei oft länger als die eigentliche Aufnahme der Bilder
am Mikroskop. Deshalb ist es besonders wichtig, neue Software-Strategien zu entwickeln,
die einerseits die Assay-Etablierung vereinfachen und gleichzeitig große Datenmengen in
kurzer Zeit verarbeiten können.
Krebs ist die zweithäufigste Todesursache in
Deutschland. Auch wenn die Ausprägungen
und Überlebensraten bei den verschiedenen
Krebsarten sehr unterschiedlich sein können,
haben alle Erkrankungen eines gemeinsam:
Eine unkontrollierte Zellvermehrung führt
zu Gewebewucherungen weit über die Organgrenzen
hinaus.
Die zelleigenen Mechanismen zur Wachstumskontrolle
sind umprogrammiert, wodurch
die Krebszellen potentiell unsterblich werden.
Lösen sich einzelne Zellen aus dem Gewebeverband
des Tumors, kommt es zur Metastasierung,
und die Überlebenswahrscheinlichkeit
des Patienten sinkt rapide. Um den Krebs
möglichst rasch und vollständig zu bekämpfen,
werden neue, noch spezifischere und besser
wirkende Medikamente entwickelt.
gerade befindet. Um dies zu optimieren, müssen
unter Umständen Verfahren angewendet
werden, die eine Anreicherung der Zellen in
der Zellteilung bewirken. Diese Verfahren sind
nicht unkritisch, weil dadurch Zellen eventuell
geschädigt werden oder ihre Eigenschaften
sich verändern. Beides kann den Effekt von
Wirkstoffen verfälschen.
Neue Verfahren gehen einen anderen Weg:
Beim Live-Cell-Imaging wird das Verhalten
lebender Zellen über ihren gesamten Lebenszyklus
aufgezeichnet. Solche Experimente
entsprechen vielmehr der physiologischen
Situation im Körper. Sie ermöglichen damit
eine sehr viel detailliertere und qualifiziertere
Aussage zum Effekt der untersuchten
Wirkstoffe. Diese Art dynamischer Studien
an lebenden Zellen sind grundsätzlich nur
mit automatisierten Verfahren im höheren
Durchsatz realisierbar.
Ein computergesteuertes Mikroskop nimmt
Bildsequenzen der lebenden Zellen auf, die
anschließend von verschiedenen Bildanalysealgorithmen
ausgewertet werden. Dies hat
nennenswerte Vorteile gegenüber manuellen
Verfahren: Ein Mensch ist nie vollständig
objektiv bei der Analyse von Bilddaten. In
der Biologie existieren häufig Grenzfälle,
die mit automatisierten Verfahren trotzdem
nach eindeutigen Kriterien bewertet werden
können. Dies setzt voraus, dass die Bilddaten
mit einer objektiven und robusten Bildanalysesoftware
verarbeitet werden können. Nur
so werden valide, statistisch abgesicherte
Resultate möglich, die eindeutige Schlussfolgerungen
zulassen.
Eine Entwicklung des Fraunhofer FIT für
diese Anforderungen ist die Software Zeta. Sie
ist darauf ausgerichtet, den Flaschenhals der
Analyse von High-Content-Screening-Daten
zu verringern und den gesamten Prozess
vom Experiment zum Ergebnis deutlich zu
beschleunigen. Das Projekt Zeta wurde vor
ca. 15 Jahren ins Leben gerufen und bereits bei
einigen unterschiedlichen Fragestellungen
eingesetzt [1,2] .
Bildanalyse
Für das High-Content-Analyse-Team von
Bayer Healthcare Berlin hat das Fraunhofer
FIT eine neue Version der Software Zeta entwww.laborwelt.de
Wirkstoffscreening
Bei der Suche nach neuen Krebsmedikamenten
werden Wirkstoffe auf lebende
Zellen appliziert. Beim Wirkstoff-Screening
geschieht dies viele Tausend- bis Millionen-
Mal in verschiedenen Ansätzen. Wirkstoffe,
die die Teilung von Krebszellen verhindern
und gleichzeitig körpereigene Zellen unberührt
lassen, haben dabei das Potential, ein
Medikament zu werden. Bei bisherigen Versuchsansätzen
geschah dies mit sogenannten
Single-Time-Point-Assays.
Die Zellen werden mit den Wirkstoffen inkubiert,
zu einem bestimmten Zeitpunkt fixiert
und anschließend gefärbt. Dabei hat man nur
bedingt Kontrolle darüber, in welcher Phase
sich die Mehrzahl der beobachteten Zellen
Abb. 1: Graphische Oberfläche von Zeta. Der Benutzer sieht nur die Optionen, die für die
Analyse der Daten nötig sind.
LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 33

Zellbiologie Imaging
wickelt. Sie kommt besonders gut mit großen
Datenmengen zurecht, wie sie bei präklinischen
Wirkstoffuntersuchungen anfallen. Ziel
ist es, die Teilung von lebenden Krebszellen
zu beobachten und zu quantifizieren. Eine
besondere Herausforderung an die Bildanalyse
besteht darin, die einzelnen Phasen der
Teilung zu differenzieren und sie miteinander
in zeitlichen Bezug setzen zu können. Die Zel-
Daten sich teilender Zellen optimiert. Der
Benutzer kann sich während der Arbeit mit
der Anwendung nacheinander durch die
Plug-Ins klicken.
Bewegungsartefakte, die durch kleine Verwackelungen
des Mikroskoptisches während
der Bildaufnahme entstehen, werden durch
das Registrierungs-Plug-In eliminiert. Dieses
richtet die einzelnen Bilder einer Zeitserie neu
zueinander aus. Der Prozess der Registrierung
ist für jede Art von Live-Cell-Imaging-Daten
erforderlich.
Mit dem Vordergrund-Hintergrund-Plug-
In werden die Zellobjekte vom Hintergrund
getrennt. An dieser Stelle bietet Zeta ein
interaktives Verfahren an. Der Benutzer
markiert mit der Maus einige Zellen und
Hintergrundregionen.
Die Software lernt anhand dieser Beispiele,
wie Zellen vom Hintergrund unterschieden
werden können und gibt direkt ein visuelles
Feedback. Der Anwender sieht, welche Regionen
Zeta als Vordergrund und welche als
Hintergrund klassifiziert hat, und kann diese
Erkennung verbessern, indem er Beispiele
hinzufügt oder entfernt. Die Software wird
auf diese Weise trainiert, die Zellen vom
Hintergrund bestmöglich zu trennen. Diese
Trainierbarkeit ist ein Schlüsselkonzept
der Software, weil dadurch die Flexibilität
erhöht wird.
Das Segmentierungs-Plug-In, ermöglicht
die Trennung von Zellclustern in einzelne
Zellobjekte. Dadurch ergibt sich die Möglichkeit,
jede einzelne Zelle morphologisch zu
beschreiben.
Das Klassifikations-Plug-In ist für die Sortierung
sich teilender Zellen besonders wichtig.
Mit diesem Plug-In wird jede einzelne Zelle einer
bestimmten Zellzyklusphase zugeordnet.
Durch die integrierte Trainierbarkeit genügt
es, einige Zellen beispielhaft mit einem Label
zu versehen. Diese werden anschließend auf
alle entsprechenden Zellen der Bildserien
übertragen.
Mit dem Tracking-Plug-In wird ein Zelltracking
innerhalb der aufgenommenen Zeitserie
durchgeführt. Hierbei wird für jede Zelle eine
Historie angelegt, der zu entnehmen ist, wie
lange sich eine Zelle in einer Zellzyklusphase
befindet.
Zudem bietet Zeta ein Evaluationsmodul
an, mit dem die Informationen der einzelnen
Analyse-Plug-Ins integriert werden und in
Form einer csv-Datei exportiert werden
können.
Ausblick
Abb. 2: Objekterkennung in Zeta (Konturen) und Klassifizierung nach den Zellteilungsphasen
(Farben)
len müssen nicht nur als Objekte erkannt und
den einzelnen Zellteilungsphasen zugeordnet
werden, auch das Erkennen der zeitlichen
Abfolge ist wichtig. Für jede Zelle wird also
eine Historie angelegt.
Besonders großen Wert ist bei der Entwicklung
von Zeta auf die einfache Bedienbarkeit,
die Integrierbarkeit in bestehende Datenmanagementsysteme
und die Performance
gelegt worden. Mit wenigen Mausklicks wird
die Software darauf trainiert, bestimmte
Zellmuster zu erkennen und zu klassifizieren.
Dadurch wird sie sehr flexibel und kann auch
für andere biologische Fragestellungen eingesetzt
werden.
Der Zeta-Workflow
Eine Besonderheit von Zeta ist seine Plug-
In-Struktur. Bei Arbeitsbeginn werden über
eine Konfigurationsdatei bestimmte, für die
Analyse notwendige Module in die Benutzeroberfläche
geladen.
Im Falle der Krebszellen sind folgende
Plug-Ins sinnvoll: Registrierung, Vordergrund-
Hintergrund-Erkennun, Segmentierung,
Klassifikation, Zelltracking und Evaluation.
Auswahl und Reihenfolge dieser Plug-Ins
sind für die Analyse von Live-Cell-Imaging-
Automatisierte, bildgebende Verfahren sind
etablierte Hilfsmittel für die Suche nach
neuen Wirkstoffen gegen Krebs. Oft ist dabei
die Auswertung der generierten Daten
ein Engpass innerhalb des Arbeitsprozesses.
Die hier vorgestellte Software soll den
Analyse-Workflow deutlich vereinfachen und
beschleunigen.
Während eines automatisierten Screenings
können derzeit etwa bis zu 50.000 Bilder pro
Tag anfallen. Idealerweise ist der Algorithmus
für die Bilderkennung so schnell, dass er in der
gleichen Zeit fertig ist. Rechnerisch bleiben
also weniger als zwei Sekunden pro Bild für
die Analyse.
In ersten Tests konnte Zeta diesen Wert
mit einem Server mit 20 Prozessoren
und 20 GB Arbeitsspeicher erreichen. Die
Software-Architektur ist so angelegt, dass
mit größeren Rechnern auch noch höhere
Geschwindigkeiten erzielt werden können.
Gegenstand der Forschung bleibt die Integration
der Daten.
Literatur
[1] Malthan D, Huchler R, Brandenburg A, Thielecke H, Hildebrandt
C, Zühlke D (2008). Association for Laboratory
Automation, Abstracts: pp.74
[2] Scheede S, Herpens A, Burmeister F, Oltrogge B Saenger
K, Schmidt-Rose T, Schreiner V, Wenck H, Knieps T, Berlage
T (2011) Skin Research and Technology: 17(2):186-195
Korrespondenzadresse
Dr. Andreas Pippow
Fraunhofer-Institut für Angewandte
Informationstechnik FIT
Schloss Birlinghoven,
53754 Sankt Augustin
Tel.: +49-(0)2241-14-1524
Fax: +49-(0)2241-144-1524
andreas.pippow@fit.fraunhofer.de
www.fit.fraunhofer.de
34 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT

Zellbiologie Expertenpanel
Zellbasierte Tox-Assays
Der Bedarf an in vitro-Toxizitätstests ist hoch – nicht zuletzt seitdem politische Entscheidungsträger
den Ersatz von Tierversuchen bei der Substanztestung proklamieren. Der Fortschritt läuft
dagegen langsamer als die politischen Absichtserklärungen. Denn die Test-Zulassung braucht im
Durchschnitt 10 Jahre und verschlingt hohe Kosten. Auch wenn es nach Experteneinschätzung nicht
absehbar ist, ob und wann komplexe systemische Endpunkte, wie die Reproduktionstoxizität, die
Toxizität bei wiederholter Gabe/Langzeittoxizität oder Toxikokinetik, mit in vitro-Tests messbar sein
werden, laufen Versuche an, die Paramenter anhand von omics-Daten zu modellieren, wie etwa
im von Jürgen Hescheler koordinierten Detective-Projekt oder dem Human Toxome Project.
der verschiedenen Technologien können
Biomarker mit Vorhersagekraft für humane
Toxizität in vitro entwickelt werden. Basierend
auf integrativer statistischer Analyse, systematischer
Überprüfung und Korrelation mit
in vivo-relevanten Daten, werden spezifische,
sensitive und prädiktive Biomarker entwickelt.
Die Definition genereller, relevanter
humaner Toxizitätspathways für unterschiedliche
Organsysteme eröffnet schließlich die
Möglichkeit eines systemischen Ansatzes der
Toxizitätstestung.
Thomas Hartung
Prof. Dr. Dr. med
Thomas Hartung,
Johns Hopkins
Bloomberg
School of Public
Health, Baltimore
& Univ. Konstanz
LABORWELT:
Welche Fortschritte gibt es bei in vitro-Toxizitätstests
auf Basis von Metabolomanalysen
Hartung:
Metabolomics ist auf dem Vormarsch in der
Toxikologie. Von den gängigen Omics-Technologien
ist sie am nächsten am Phänotyp,
also den tatsächlich stattfindenden Veränderungen.
Während wir mit 22.000 Genen
und ihren Transkripten oder mehr als einer
Million Proteinen umgehen müssen, gibt es nur
wenige Tausend Metabolite, die wir recht gut
inklusive ihrer metabolischen Verknüpfungen
kennen. Insbesondere die Massenspektriebasierten
Methoden der Metabolomics haben
in den letzten Jahren enorme Fortschritte
bezüglich Standardisierung und Sensitivität
gemacht, und die Kosten einer Einzelanalyse
sind relativ niedrig. Es wundert deshalb nicht,
dass die Methode zunehmend in der Toxikologie
genutzt wird. Pionierarbeiten bei BASF
haben mit Kurzzeit-Tierversuchen für rund
500 Chemikalien gezeigt, dass sich typische
Signaturen von Metaboliten-Veränderungen
für eine ganze Reihe von toxischen Effekten im
Blut nachweisen lassen. Dies wird bereits für
eine biologische Gruppierung von Substanzen
für Testungen im Rahmen der von der EU-
Chemikalienrichtlinie REACH vorgeschriebenen
Substanztestung eingesetzt und kann vermutlich
Effekte in Langzeit-Versuchen vorhersagen.
Auch Zellkulturen kommen zunehmend zum
Einsatz – wir haben bereits 2008 den Einsatz
für Entwicklungsstörungen des Gehirns beschrieben,
was jetzt von der FDA in unserem
Labor gefördert wird. Stemina in Madison
(USA) hat ganz ähnlich humane embryonale
Stammzellen mit Metabolomics kombiniert
und arbeitet mit der US EPA zusammen, um
teratogene Effekte vorherzusagen. Zudem gibt
es große Erwartungen, dass Metabolomics
in vitro bei der Identifizierung von Toxiziäts-
Pathways helfen kann, wie im NIH-geförderten
Human Toxome Project angestrebt. Wir haben
gerade mit BASF einen Workshop in Berlin
veranstaltet, der die enormen Möglichkeiten
dieser Technologie beleuchtete, aber auch noch
zu meisternde Herausforderungen gezeigt hat.
Ende des Jahres machen wir etwas ähnliches
in den USA.
Jürgen Hescheler
Prof. Dr. Jürgen
Hescheler, Direktor
des Instituts für
Neurophysiologie
an der Universität
zu Köln
LABORWELT:
Wie lassen sich komplexe Endpunkte künftig
in vitro testen
Hescheler:
Die Grundlage innovativer in vitro Toxizitätstests
ist die Entwicklung von robusten,
zuverlässigen, sensitiven und spezifischen
Biomarkern. Dabei ermöglicht die systematische
Auswertung von komplementären
funktionellen und „-omics“ Technologien, einschließlich
High-Content und High-Throughput
Screening Technologien, die Identifizierung
und Untersuchung humaner Biomarker
in zellulären Modellen. Während funktionelle
Parameter Einblicke in die Wirkung von
Schadstoffen auf spezifische Zellfunktionen
geben, liefern „-omics“-Technologien Informationen
zur gesamten zellulären Situation
auf molekularer Ebene. Die Auswirkungen von
Wirkstoffen auf Epigenetik und microRNA
Expression versprechen unser Verständnis
von toxischen Wirkmechanismen vertiefen
zu können. Diese beiden Parameter haben
sich als kritisch für das Verhalten der Zelle
herausgestellt und es gilt nun, zu evaluieren,
inwiefern die Anwendung von Chemikalien
Zellen auf dieser Ebene beeinflussen. Durch
Kombination und anschließende Integration
Dirk Dressler
Dr. Dirk Dressler ist
leitender Mitarbeiter
bei der BioTeSys
GmbH und zuständig
für die Auftragsforschung
in vitro-
Wirknachweise.
LABORWELT:
Welche Fortschritte gibt es bei der Automation
der in vitro-Genotoxizitätstestung
Dressler:
Die in vitro-Prüfung einer Substanz auf genotoxischer
Substanzeigenschaften erfolgt zur
Zeit durch eine Kombination von verschiedenen
Testverfahren, wobei jedoch z.T. falsch
positive Aussagen auftreten. Der FADU-Assay
(Fluorimetric detection of Alkaline DNA Unwinding)
bietet hier neue Möglichkeiten. Er
ist automatisiert einsetzbar und zeichnet sich
durch eine hohe Sicherheit und eine einfache,
schnelle und robuste Durchführung aus.
Neben bereits etablierten Zelllinien werden
nun auch komplexe Gewebemodelle als Testgrundlage
etabliert. Mit dieser Technologie
können DNA Strangbrüche und DNA Repair
getrennt erfasst werden. Wichtiges Kriterium
ist dabei, dass die Einwirkzeit der Testsubstanzen
sehr variabel (von sehr kurz bis lang)
gewählt werden kann. So ist es erstmals möglich
beide Prozesse in sensitiver und reproduzierbarer
Weise zuverlässig zu detektieren.
Es können wie gezeigt DNA Strangbrüche in
peripheren Blutlymphocyten nachgewiesen
werden, die von verschiedensten Chemikalien
hervorgerufen wurden. Chemikalien ohne
genotoxisches Profil fungierten als Negativ-
Kontrolle. Zur Zeit wird dieses der FADU-Assay
bei der Bewertung möglicher genotoxischer
Eigenschaften von Nanopartikeln geprüft.
So kann die Kombination von intelligentem
Assay und Automatisierung Grenzen der
Analytik erweitern und mehr Sicherheit in der
Bewertung erreicht werden.
www.laborwelt.de
LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 35

Branche Labormarkt im Umbruch
Qiagen: Auf der Suche
nach Wachstumstreibern
Dr. Patrick Dieckhoff, BIOCOM AG
Milliardenschwere Übernahmen sind gang und gäbe im Labormarkt. Grund genug, in dieser
LABORWELT-Serie einen Blick auf die Player, ihre Strategien und Deals zu werfen. Klar ist:
Elefantenhochzeiten bleiben an der Tagesordnung. Die Preise bleiben hoch, genauso wie die
Wahrscheinlichkeit, dass sich der Labormarkt in zehn Jahren völlig anders darstellen wird als
heute. Die Qiagen NV hat sich in den vergangenen Jahren durch Übernahmen selbst transformiert.
Früher ausschließlich als Laboranbieter bekannt, ist das Unternehmen heute ein
Spezialist für Molekulardiagnostik und personalisierte Medizin. Diese Wachstumsbereiche
müssen Schwächen im Portfolio der Hildener ausgleichen.
Qiagen in Zahlen:
Umsatz: 1,17 Mrd. US-$
Gewinn (operativ): 319,6 Mio. US-$
Umsatzrendite: 27 %
F&E-Investiton: 12 % des Umsatzes
Börsenwert: 2,68 Mrd. Euro (Stichtag 6.3.)
Mitarbeiter: 3.600
CEO:
Peer Schatz
Umsätze: regional
– Europa 36 %
– Asien 18 %
– Nord- und Südamerika 46 %
Kunden nach Umsatz:
– Molekulardiagnostik (50 %)
– Applied Testing (7 %)
– Pharma (19 %)
– Akademia (24 %)
Vor nicht allzu langer Zeit war die Qiagen NV
ein ganz normaler Laborzulieferer. Die charakteristischen
blauen Packungen standen auf fast
jeder Bench. Doch der Erfolg war gleichzeitig
ein Fluch. Das Unternehmen wuchs nur noch
schleppend. Unternehmenschef Peer Schatz
und seine Kollegen wagten die Flucht nach
vorn. Die 40 Mio. US-$ teure Akquisition des
Hamburger Molekulardiagnistik-Pioniers Artus
GmbH im Jahr 2005 war der Auftakt für
die Transformation des Unternehmens hin zu
einem Geräte- und Testentwickler. 2007 folgte
schließlich der Paukenschlag. Für die bemerkenswerte
Summe von 1,7 Mrd. US-$ verleibte
sich Qiagen den US-amerikanischen Spezialisten
Digene Corp. ein. „Dies ist ein Schritt in
eines der am schnellsten wachsenden Felder
der Molekulardiagnostik“, sagte Schatz nach der
Übernahme und meinte damit vor allem die Diagnostik
von humanen Papillomviren (HPV), die
Gebärmutterhalskrebs auslösen können. In den
folgenden Jahren verleibten sich die Hildener
weitere Firmen ein, darunter die französische
Ipsogen, einen Spezialisten für Hämatologie.
Die Strategie dahinter: Es geht darum, Qiagens
Analyseplattform QiaSymphony auszulasten.
Content is king! Je mehr Tests für sie verfügbar
sind, desto attraktiver werden die Geräte.
Starker Wettbewerb
Die Konkurrenz ist namhaft: Mit Siemens, Abbott
und Roche streiten sich Großkonzerne mit
Qiagen um die Gunst der Diagnostik-Labore. Bis
Ende 2011 waren weltweit 550 QIAsymphony
Geräte installiert. Im laufenden Jahr soll die
Zahl auf 750 Stück steigen. Der Verkaufspreis ist
dabei nicht entscheidend – oft werden solche
Geräte auch geleast. Vielmehr sind es die Verkäufe
von passenden Reagenzien und Tests, die
sich pro Gerät auf etwa 50.000 bis 60.000 US-$
pro Jahr belaufen. Im Jahr 2011 stammte bereits
fast die Hälfte von Qiagens Jahresumsätzen
– 2011 waren das 1,17 Mrd. US-$ – aus der Molekulardiagnostik.
Die akademische Forschung,
einst dominierendes Segment, trägt heute nur
noch ein Viertel des Umsatzes. Die Kundenbasis
vervollständigen Pharmaunternehmen (19 %)
und Spezialisten für Applied Testing (7 %). Unter
allen Bereichen wuchsen die Einnahmen aus
Akademia am schwächsten. Im vergangenen
Jahr stiegen die Umsätze in diesem Bereich
gerade einmal um 3 %.
Vor allem in den USA sinken die Ausgaben für
öffentliche Forschung, was sich in den Zahlen
niederschlägt. Auch in der näheren Zukunft
werde sich das nicht ändern, glaubt Qiagens
Management. Generell macht Deutschlands
größtem Biotech-Unternehmen mit 3.600
Mitarbeitern die derzeitige Schwäche wichtiger
Märkte wie den USA zu schaffen. Weil
sich hier die finanzielle Situation auch von
Privatleuten verschlechtert hat, wird immer
weniger Geld für Vorsorge ausgegeben. Damit
ist Qiagen abhängig von der Entwicklung der
Weltwirtschaft. Entsprechend schlecht verkaufen
sich die HPV-Tests des Unternehmens.
Marktbeobachter glauben nicht, dass sich das
so schnell ändern wird.
Endmontage einer QIAsymphony-Plattform.
Die makroökonomische Gefahr
Und so ist das Unternehmen auf der Suche
nach neuen Wachstumsfeldern. Die sieht das
Management vor allem in der personalisierten
Medizin. Auch hier half Qiagen wieder eine
Übernahme. Nach dem Kauf der britischen DxS
im Jahr 2009 positionieren sich die Hildener als
Partner für Pharmakonzerne, die zunehmend
auf der Suche nach begleitenden Diagnostika
für ihre Medikamente sind. Nur wenige
Unternehmen wie Roche oder Abbott haben
diese Expertise im eigenen Haus. Die meisten
Unternehmen müssen hier zukaufen. Qiagen
hat sich als Partner für Branchengrößen wie
Eli Lilly oder Pfizer positioniert. Es bleibt abzuwarten,
wie erfolgreich Qiagens Diagnostik-
Entwicklungsplattform sein wird.
36 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT

Stellenmarkt Service
Akademischer Stellenmarkt
Institute of Gender in
Medicine Berlin
Doctoral student
The group of Prof. Regitz-Zagrosek / Dr. Mahmoodzadeh is looking for a motivated
PhD student with expertise in cardiomyocyte Ca2+-signaling, interest
in sex hormone effects, and in animal surgery. We offer a 3 years position with
integration into an internationally well connected active research group with
expertise in cellular/molecular biology, mitochondrial function, human tissue
and animal models. Main research focus of our group is the investigation of
sex differences in myocardial hypertrophy (for more information, please visit
our web sites at: http://gender.charite.de or
http://www.ccr.charite.de/en/research/research_group_regitz_zagrosek/
Requirements
– A highly motivated candidate with an interest in cellular and molecular biology
and cardiomyocyte physiology
– Candidates applying for a PhD position must hold a Master/Diploma degree
in the natural sciences or related disciplines, an excellent academic record
and practical experience in molecular and cellular biology; having obtained
a certificate for conducting animal experiments is an advantage.
Employment
Successful candidate will be employed from April 2012 on for 36 months
Application letters including a CV and contact details of three referees should
be sent before March 20, 2012 to:
Dr. Shokoufeh Mahmoodzadeh
Charite-Universitätsmedizin
Institute of Gender in Medicine (GiM)
Center for Cardiovascular Research (CCR)
Hessische Str. 3-4, 10115 Berlin, Germany
or via email: s.mahmoodzadeh@charite.de
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FMI International
PhD Program in
Biomedical Research
Applications are invited for internally funded PhD student fellowships at the
Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research (FMI) in Basel, Switzerland.
The FMI is part of the Novartis Research Foundation and is affiliated with
the University of Basel. Our research focuses on epigenetics, mechanisms of
cancer and neurobiology. We employ state-of-the-art technologies to explore
basic molecular mechanisms of cells and organisms in health and disease.
Our international PhD program has approximately 100 graduate students from
more than 25 countries. The working language is English. Most students are
registered at the University of Basel. The successful candidate holds a Diploma
(or M.Sc.) acceptable for matriculation at the University and has a strong
background in cell and molecular biology.
Current topics include: Biology of aging / cancer and metastasis / DNA repair /
cell adhesion / protein structure / proteomics and genomics / molecular mechanisms
of cell signaling / cell type specification and differentiation / connectivity
and functionality of neuronal circuits / vision, olfaction, motor control / synaptic
plasticity / brain and behavior / learning and memory / sensory processing /
epigenetic regulation and chromatin modification / gene expression and silencing
/ genomic integrity / microRNAs and posttranscriptional regulation.
Research group leaders: Joy Alcedo / Silvia Arber / Momo Bentires-Alj / Marc
Bühler / Pico Caroni / Ruth Chiquet-Ehrismann / Rafal Ciosk / Witold Filipowicz /
Rainer Friedrich / Susan Gasser / Helge Grosshans / Brian Hemmings / Nancy
Hynes / Georg Keller / Andreas Lüthi / Patrick Matthias / Thomas Oertner /
Antoine Peters / Jan Pielage / Ulrich Rass / Filippo Rijli / Botond Roska / Dirk
Schübeler / Nicolas Thomä
Financial support is in accordance with the scale of the Swiss National Science
Foundation. Your income will be generous relative to international standards for
PhD students. Duration of the appointment is typically 4 years.
Application forms and further information:
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phdprogram@fmi.ch
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LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 37

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Die Mitglieder der nachfolgenden Fachgesellschaften erhalten LABORWELT regelmäßig mit
freundlicher Empfehlung ihrer Organisationen. Wer sich darüber hinaus für eine Mitarbeit oder
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und Toxikologie
Geschäftsstelle der DGPT
Achenbachstraße 43
40237 Düsseldorf
Tel.: +49-(0)-211-600-692-77
Fax: +49-(0)-211-600-692-78
mitglieder@dgpt-online.de
www.dgpt­online.de
Nationales Genomforschungsnetz
c/o DKFZ
Im Neuenheimer Feld 580
69120 Heidelberg
Tel.: +49-(0)-6221-424-743
Fax: +49-(0)-6221-423-454
S.Argo@dkfz-heidelberg.de
www.ngfn.de
DiagnostikNet­BB
Netzwerk Diagnostik
Berlin-Brandenburg e.V.
Neundorfstraße 17
16761 Henningsdorf
Tel.: +49-(0)-3302-55-199-14
Fax: +49-(0)-3302-55-199-10
f.adams@diagnostiknet-bb.de
www.diagnostiknet­bb.de
Verband der Diagnostica­Industrie e.V.
Verband der
Diagnostica-Industrie e.V.
Neustädtische Kirchstr. 8
10117 Berlin
Tel.: +49-(0)-30-200-599-40
Fax: +49-(0)-30-200-599-49
vdgh@vdgh.de
www.vdgh.de
Österreichische
Reinraumgesellschaft (ÖRRG)
ÖRRG
Neudorf 41
A-8262 Ilz
Tel.: +43-(0)-3385-8117
Fax: +43-(0)-3385-8117
office@oerrg.at
www.oerrg.at
bts (Biotechnologische Studenteninitiative
e.V.)
c/o BIOCOM
Lützowstraße 33–36
10785 Berlin
Tel.: +49-(0)-30-2649-21-21
Fax: +49-(0)-30-2649-21-11
www.bts­ev.de
Deutsche Gesellschaft für
Neurogenetik
Institut für Humangenetik
Calwer Straße 7
72076 Tübingen
Tel.: +49-(0)-7071-2977692
Fax: +49-(0)-7071-295171
peter.bauer@
med.uni-tuebingen.de
www.hih­tuebingen.de/dgng/
Österreichische Ges. f. Laboratoriumsmedizin
& Klinische Chemie
ÖGLMKC Geschäftsstelle
Infomedica-KEG, Xenius Behal
Tullnertalgasse 72
A-1230 Wien
Tel./Fax: +43-(0)-1889-6238
office@oeglmkc.at
www.oeglmkc.at
38 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT

Produktwelt Service
Greiner Bio-One
Mini-Bioreaktor für
Particular
Biokunjugiertes Gold aus dem Laserlabor
kleine Probenmengen Die Particular GmbH in Hannover hat 2010
Der neue CELLreactor von Greiner Bio-One
ist ein mit Filterschraubverschluss ausgestattetes
innovatives 50 ml-Röhrchen aus
Polypropylen. Es ermöglicht die Miniaturisierung
großer Probenvolumina bei gleichzeitiger
Maximierung paralleler Experimente
innerhalb eines Versuchsansatzes. Damit ist
es als kleiner Bioreaktor für die Kultivierung
von Zellen einsetzbar.
Jeder CELLreactor-Verschluss besitzt eine
spezifische nach USP Class VI zertifizierte
ihr Geschäft als weltweit erster Produzent
lasererzeugter Nanomaterialien aufgenommen.
Angeboten werden Nanopartikel aus
verschiedensten Metallen, Legierungen oder
Keramiken, die stabil in Wasser, Aceton oder
anderen Lösungsmitteln dispergiert sind. Die
hohe Reinheit, Vielfalt und Flexibilität prädestinieren
die Produkte für die nanotechnologische
Forschung und Entwicklung.
Neben ligandenfreien Nanopartikel-
Dispersionen bietet Particular seit 2011
auch Goldkonjugate mit Oligonukleotiden,
Peptiden und Antikörpern an, die in einigen
Millilitern Wasser perfekt dispergiert sind. Der
physikalische Laserabtrag macht die Gold-
Konjugate besonders rein sowie kostengünstig,
und durch die hohe Oberflächenaktivität
der Partikel wird die Affinität des Goldes zu
Biomolekülen mit schwefelhaltigen Gruppen
besonders effizient ausgenutzt. Die Folge
sind mehr Moleküle pro Partikel und weniger
Molekülverluste.
Die Goldpartikel besitzen einen Durchmesser
von ca. 10 nm und können mit Funktionsmolekülen
wie zellpenetrierenden Peptiden
oder DNA verbunden werden, die das Gold
nicht nur sichtbar macht, sondern auch als
universelles Verbindungselement koppelt. Die
besonderen optischen Eigenschaften erlauben
leichte Nachweise und Charakterisierung.
Während für viele Laborversuche heute noch
toxische Farbstoffe verwendet werden, wird
Gold besonders interessant, wenn die Ergebnisse
auch auf Gewebe übertragen werden
sollen. Kleine Mengen an Gold lösen keine
unerwünschten Reaktionen aus. So sollen Biologen
ihre Substanzen künftig beispielsweise
durch Zellmembranen transportieren und mit
DNA-Sequenzen verbinden, um Krankheiten
zu erkennen oder zu bekämpfen.
Particular GmbH
Dr.-Ing. Niko Bärsch
Hollerithallee 8
30419 Hannover
Tel.: +49-(0)511-2788-313
Fax: +49-(0)511-2788-100
sales@particular.eu
www.particular.eu
Polytetrafluorethylen beschichtete Kapillarporenmembran
mit einer Porengröße von 0,2
µm. Diese Membran garantiert die Sterilität
des Röhrcheninhalts. Sie stellt außerdem
einen ausgezeichneten Gasaustausch sicher.
Das Durchmischen der Flüssigkeiten erfolgt
mit Standard-Laborschüttlern, so dass
Schaumbildung und zelluläre Scherkräfte
während der Kultivierung minimiert werden
können.
Ein weiterer Vorzug des CELLreactors ist,
dass für die Zellernte kein Transfer erforderlich
ist. Aufgrund seiner konischen Form
passt das Röhrchen in alle gängigen 50 ml-
Zentrifugenrotoren, und die Zellen können
innerhalb des Röhrchens direkt sedimentiert
werden. Neben den Zellkulturanwendungen
eignet sich der CELLreactor für die Expansion
von aeroben Bakterien, Hefen und anderen
Mikroorganismen in Schüttelkulturen
sowie für die Lagerung von Komponenten
und Flüssigkeiten, die einen Gasaustausch
benötigen.
Greiner Bio-One GmbH
Sylvia Bauer
Tel.: +49-(0)7022-948-0
marketing@de.gbo.com
www.gbo.com/bioscience
Dunn Labortechnik
Dunn Labortechnik erweitert Produktportfolio
von Laborkleingeräten
Neu im Programm bei Dunn Labortechnik
sind Geräte der englischen Firma Medline
Scientific Ltd.
Neben kostengünstigen Laborkleingeräten
für allgemeine Anwendungen, wie
Magnetrührer, Heizmäntel, Exsikkatoren,
Elektrobrenner und Overhead-Rührer, werden
auch Spezialgeräte wie Pflanzenwachstumskammern,
Öfen und Niedrigtemperatur-
Inkubatoren angeboten.
Die große Auswahl an Heizmänteln und
Exsikkatoren dürfte besonders für Chemielabore,
die Niedrigtemperatur-Inkubatoren z.B.
für die Zellkultur und die Pflanzenwachstumskammern
speziell für botanische Anwendungen
interessant sein.
Günstig und einfach in der Bedienbarkeit,
sind die Magnetrührer u.a. für Schülerlabore
oder Praktika zu empfehlen, während die
Elektrobrenner eine interessante und sichere
Alternative zu gasbetriebenen Brennern in
Laboren darstellen.
Dunn Labortechnik GmbH
Thelenberg 6
53567 Asbach
Tel.: +49-(0)-268-343-094
Fax: +49-(0)-268-342-776
info@dunnlab.de
www.dunnlab.de
LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 39

Service Produktwelt
Promocell
Der PromoCell-Turbo für die Stammzell-Forschung
Auf Grund ihrer einzigartigen biologischen
Eigenschaften gewinnen Mesenchymale
Stammzellen (MSC) in vielen Forschungsgebieten
zunehmend an Bedeutung.
PromoCell, der Spezialist für die Kultur humaner
primärer Zellen, beliefert seine Kunden
schnell und zuverlässig mit einem breiten
Spektrum an Produkten für die Stammzellforschung.
Primäre humane MSC werden bei Promo-
Cell unter strengen ethischen Richtlinien aus
unterschiedlichen Geweben isoliert, zum Beispiel
aus Knochenmark, Fettgewebe oder der
Nabelschnur-Matrix. Jede Charge unterliegt
einer ausführlichen Charakterisierung und
strengen Qualitätstests.
Für die Kultur bzw. die gezielte in vitro-
Differenzierung von MSC ist PromoCell als
Lieferant für gebrauchsfertige, optimierte
Expansions- und Differenzierungsmedien ein
etablierter Partner. Das Unternehmen erweitert
sein Portfolio nun durch ein neu entwickeltes
serumfreies MSC-Expansionsmedium, das MSC
Growth Medium DXF (definiert/xeno-frei).
Das MSC Growth-Medium DXF wurde
von PromoCell speziell für die Kultur von
multipotenten, undifferenzierten MSC unter
chemisch definierten, xeno-freien Bedingungen
entwickelt. Die gezielte Aktivierung der
Selbsterneuerung garantiert die robuste Proliferation
von MSC und eine hohe Zellausbeute.
Die Primär-Isolation von MSC, zum Beispiel aus
Knochenmark, wird ebenfalls unterstützt.
PromoCell GmbH
Sickingenstraße 63/65
69126 Heidelberg
Tel.: +49-(0)6221-649340
info@promocell.com
www.promocell.com
Porvair
Besonders einfache SPE-
Verfahrensentwicklung
Porvair Sciences hat eine Version seiner beliebten
Festphasenextraktions-Mikroplatten
Microlute (SPE) eingeführt, die eine breit
gefächerte Palette an Phasenchemikalien und
Sorbentladungen auf einer einzigen Platte
ermöglicht und somit für die Methodenentwicklung
ideal ist. Durch die Mischung aus
Promocell
Multiplex-ELISA für Immun- und Molekularbiologie
PromoFectin ermöglicht einen hocheffizienten
und reproduzierbaren Transport von
Nukleinsäuren in eine Vielzahl adhärenter und
nicht-adhärenter Zelltypen – mit oder ohne
Mediumwechsel. Es zeigt extrem geringe Zytotoxizität
und ist daher für die Transfektion
sehr empfindlicher und schwer zu transfizierender
Zell-Linien und primärer Zellen bestens
geeignet. PromoFectin komplexiert und schützt
die Nukleinsäuren und bewirkt in der Zelle
eine sehr effiziente und schnelle Freisetzung
der Nukleinsäuren und deren Transport in
den Zellkern. Varianten von PromoFectin sind
speziell auch für eine optimale Transfektion
von Endothelzellen (z.B. HUVEC), Hepatozyten
und Makrophagen sowie neuronaler Zellen
und Insektenzellen entwickelt worden. Weitere
PromoFectin-Varianten für den Transport von
siRNA und funktionellen Proteinen/Peptiden
in Zellen sind ebenfalls erhältlich.
Die „Magnet-Assisted Transfection“-Technologie
(MATra) wurde für eine sehr schnelle (ca. 15
Minuten) und hocheffiziente Transfektion einer
Vielzahl von Zelltypen entwickelt und zeigt –
ebenfalls mit oder ohne Serum – exzellente
Ergebnisse auch mit vielen bekanntermaßen
schwer zu transfizierenden Zelltypen (wie etwa
Primärzellen) sowie eine geringe Zytotoxizität.
Die MATra-A Reagenz besteht aus einer Suspension
speziell beschichteter magnetischer
Nanopartikel, welche die interessierenden
Nukleinsäuren (z.B. Plasmid-DNA, Oligonukleotide
oder siRNA) binden und komplexieren.
Durch ein starkes magnetisches Feld unter
den zu transfizierenden Zielzellen werden die
MATra-A/Nukleinsäure-Komplexe sehr schnell
und quantitativ auf die Zellen gezogen und in
hoher Dosis direkt auf den Zellmembranen abgelegt,
was zu einer sehr effizienten Aufnahme
der Komplexe in die Zellen führt. Die MATra-A
Reagenz ist für die Transfektion von adhärenten
Zellen konzipiert, doch lassen sich auch Suspensionszellen
mittels eines einfachen Zwischenschritts
(mit dem MATra-S Immobilizer) optimal
transfizieren. Zusätzlich bietet PromoKine das
MA Lipofection Reagent an, das mit den meisten
gebräuchlichen Transfektionsreagenzien
kombiniert werden kann, um Transfektionsergebnisse
mittels der MATra-Technologie noch
weiter zu optimieren.
Mehr Informationen zur aktuellen PromoFectin-Sonderaktion
gibt es unter:
www.promokine.info/promotion
PromoCell GmbH
Sickingenstraße 63/65
69126 Heidelberg
Tel.: +49-(0)649 34-0
Fax: +49-(0)649 34-40
www.promokine.info
info@promokine.de
Phasenchemikalien und Sorbentladungen,
die bei der Development Microlute zur Verfügung
steht, wird eine schnelle und einfache
Untersuchung auf die optimale Bindung und
Selektivität möglich.
Mit Development Microlute hat der
Benutzer auf einer 96-Loch-Mikroplatte im
Standardformat eine einzigartige Auswahl
aus bis zu zwölf unterschiedlichen Phasen-
und Sorbentladungen (10 bis 100 mg).
Durch Bereitstellung einer kompletten SPE-
Verfahren-Entwicklungslösung, die nicht vom
Anwender konstruiert werden muss, kann
der Zeitaufwand im Labor mit Development
Microlute erheblich verkürzt werden. Die
neuartige Bauart des Development Microlute
bietet alle Vorteile einer automatisierten SPE-
Probenvorbereitung. Einzelne SPE-Kartuschen
müssen nicht wiederholt ein- und ausgesteckt
werden. Durch Verwendung eines patentrechtlich
geschützten Slurry-Ladeverfahren
konnte Porvair die Kanalisierungsauswirkungen
vermeiden. Jede Senke einer Development
Microlute-Platte verfügt über eine
individuelle Ablasstülle, so dass ein 100%iger
Probentransfer gewährleistet ist, bei dem eine
Kreuzkontamination ausgeschlossen werden
kann. Development Microlute-Platten von
Porvair sind zu allen gängigen Roboter-Probenhandhabungs-
und Vorbereitungssystemen
kompatibel, was einen problemlosen Betrieb
mit hoher Produktivität gewährleistet.
Porvair Sciences Ltd.
Dr. Bill Bradbury
Tel.: +44-(0)208-546-0869
info@primetek-solutions.com
www.porvair-sciences.com
40 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT

Kalender Service
März – Mai 2012
Veranstaltungskalender
19.-21.3.12
BIO-Europe Spring® 2012
International Partnering Conference,
Amsterdam (NL)
Info: www.ebdgroup.com/bes
19.-20.3.12
2 nd Symposium on the Replacement,
Reduction and Refinement of Animal
Experiments, Hannover
Info: www.tiho-hannover.de
19.-21.3.12
6 th Glycan Forum, Berlin
Info: www.glycan-forum.de
20.3.12
Update Innovationsforum Bewertung,
Regulierung, Erstattung, Berlin
Info: www.diagnostiknet-bb.de
27. März 2012, Erlangen
Zellbasierte Therapien
Auf dem Kooperationsforum „Zellbasierte
Therapien„ in Erlangen werden Fortschritte
in der Stammzellforschung und der Zellbiologie
vorgestellt. Zu den Schwerpunktthemen
gehören Plattformtechnologien für die
Stammzellproduktion und therapeutische
Anwendungen in der Immunologie.
Info: www.bayern-innovativ.de/
zelltherapie2012
21.-24.3.12
35. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft
für Zellbiologie, Dresden
Info: www.zellbiologie2012.de
26.-28.3.12
24 th DIA-EuroMeeting, Kopenhagen (DK)
Info: www.diahome.org
26.-29.3.12
5 th Companion Diagnostics Summit,
Frankfurt (Main)
Info: www.companion-dxeurope.com
20. April 2012, München
jobvector career day
Neben persönlichen Gesprächen mit Personalverantwortlichen
aus Biotechnologie,
Pharma, Medizin und den Life Sciences
bietet der jobvector career day ein umfangreiches
Vortragsprogramm.
Info: www.jobvector.de/muenchen
26.-27.3.12
5. Bundesalgenstammtisch, Pullach
Info: www.dechema.de/algen2012
27.-29.3.12
Bioassays and Bioanalytics & Stability Testing
for Biological/Biotechnological Drug Substances
and Drug Products, Kopenhagen (DK)
Info: www.gmp-navigator.com
28.-29.3.12
Advances in Microarray Technology,
Edinburgh (UK)
Info: https://selectbiosciences.com/conferences/
AMT2012
2.-5.4.12
Protein Modellierung – von der Sequenz zur
Struktur, Erlangen
Info: http://kwi.dechema.de/PM.htm
10.-12.4.12
Environmental Microbiology & Biotechnology
Conference 2012, Bologna (I)
Info: www.efb-central.org
16.-20.4.12
WFC11 – 11 th World Filtration Congress, Graz (A)
Info: www.wfc11.org
17.-20.4.12
Analytica 2012, München
Info: www.analytica.de
19.4.12
6. Biotech-Tag der FH Bingen
Info: www.fh-bingen.de
19.-20.4.12
10 th EGA International Symposium on
Biosimilar Medicines, London (UK)
Info: www.gpaconferences.com
23.-24.4.12
Charité Entrepreneurship Summit 2012,
Berlin
Info: www.charite-summit.de/2012
25.4.12
Einführung in die „Gute Laborpraxis“,
Karlsruhe
Info: www.fortbildung.kit.edu
25.-27.4.12
GMP for Vaccine Manufacturers, Berlin
Info: www.gmp-navigator.com
1.5.12
Companion Diagnostics – from Early
Drug Discovery to Clinical Application,
Thame, Oxfordshire (UK)
Info: www.elrig.org
2.-4.5.12
9 th International Conference on Protein
Stabilisation, Lisbon (PT)
Info: http://prostab2012.ist.utl.pt
2.-5.5.12
7 th International Symposium on
Neuroprotection and Neurorepair, Potsdam
Info: www.neurorepair-2012.de
7.–9. Mai 2012, Basel
Klinische Nanomedizin
Alle Facetten der Nanomedizin werden
auf dem European Summit for Clinical
Nanomedicine 2012 behandelt. Programmschwerpunkte
sind Themen wie
Drug Delivery, Nanodiagnostik und
regenerative Medizin
Info: www.clinam.org
LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 41

Ausblick
Next-next-Generation
Sequencing ist marktreif
von Thomas Gabrielczyk, Redaktion LABORWELT
Vor fast drei Jahren berichtete das kleine Unternehmen Oxford Nanopore in LABORWELT über den
Prototypen eines Nanopore-Sequencers, der auf Basis von Leitfähigkeitsmessungen hochparallel
die Sequenz von (c)DNA-Einzelsträngen ausliest, die in einen Chip eingebettete Hämolysin-Poren
passieren (LABORWELT 3/2009). Mitte Februar kündigte das Unternehmen auf der AGBT-Konferenz
(Marco Island, Florida) den Vermarktungsstart für seine Technologie noch in diesem Jahr an.
Wie alle Geräte, die neu auf den hochdynamischen
Markt der Hochdurchsatz-Sequencer
kommen, werden auch das GridION-System
(Durchsatz mind. 10Gb/Tag) und das Einweg-
System MinION (Durchsatz mind. 1.2 Gb/Tag),
das die Größe eines USB-Sticks hat, ihre Kinderkrankheiten
haben. Derzeit liegt die Fehlerrate
mit 4% beim Basecalling noch viel zu hoch. Doch
das Potential der neuen Methode ist gigantisch.
Neben Leselängen, die das Sanger-Sequencing
gleich bei der Vorstellung der ersten Sequenzierungsdaten
um das Zehnfache übertrafen
(10.000 Basen pro Lauf!), versprechen der Datendurchsatz
und der Preis pro Base, bereits
bei Vermarktungsbeginn genauso günstig
zu sein wie der des derzeit unangefochtenen
Weltmarktführers Illumina. Doch wird der in
Aussicht gestellte Preis von $10/Gb auf dem
GridION und $1.000/Gb auf dem Minion weiter
fallen. Denn als erste Firma bietet Oxford Nanopore
eine Sequenzierungstechnologie an, die
weder teure Fluoreszenzkameras noch Fluoreszenzfarbstoffe
für die Signaldetektion braucht,
noch auf die vorherige Amplifikation der DNA
mit PCR angewiesen ist, um eine ausreichende
Signalstärke zu erreichen.
Gleichwohl muss Illumina die Nanopore-
Sequenzer GridION und MinION nicht fürchten.
Denn die US-Firma hat sich früh die Rechte an
einer noch genaueren Version des Verfahrens
gesichert, über dessen Entwicklungsstand
die Briten indes nichts verraten: Anders als
beim „Strand Sequencing“ wird bei diesem
Impressum
LABORWELT (ISSN 1611-0854)
erscheint vierteljährlich im Verlag der
BIOCOM AG
Lützowstraße 33–36
10785 Berlin, Germany
Tel./Fax: 030/264921-0 / 030/264921-11
laborwelt@biocom.de
www.biocom.de
Redaktion
Dipl.-Biol. Thomas Gabrielczyk
Tel.: 030/264921-50
Anzeigenleitung
Oliver Schnell
Tel. 030/264921-45,
o.schnell@biocom.de
Leserservice
Angelika Werner, Tel. 030/264921-40
Graphik-Design
Michaela Reblin
www.laborwelt.de
Druck:
Druckhaus Humburg GmbH, 28325 Bremen
„Exonuclease Sequencing“ nicht ein intakter
DNA-Einzelstrang durch die Pore geschleust.
Statt dessen haben die Briten eine Exonuclease
an die Nanopore fusioniert, die die DNA
bindet und jeweils ein Nucleotid vom Ende
her abschneidet – das verspricht, die mäßige
Genauigkeit des Verfahrens um ein Vielfaches
zu verbessern. Denn – anders als beim Strand
Sequencing – muss keine technische Lösung
dafür gefunden werden, den DNA-Strang am
schnellen Durchtritt durch die Pore zu hindern
und dessen Geschwindigkeit so zu verlangsamen,
dass tatsächlich Base für Base abgelesen
wird – ein derzeit nur unbefriedigend gelöstes
Problem, an dem auch Illumina-Konkurrent
Roche gemeinsam mit Partner IBM knobelt.
Hope & Hype
In ihren Ankündigungen übertreffen sich
derzeit die Anbieter. Anfang Januar kündigte
Life Technology ein update seiner IonTorrent-
Pyrosequencing-Plattform an, die anstelle eines
Fluoreszenz-Readouts die Halbleitertechnologie
nutzt. Gegen das Nanopore-Sequencing können
sowohl der Ion PGM Sequencer und sein größerer
Bruder Ion Proton indes schon wegen der
50-fach geringeren Leseweite nicht bestehen.
Wer das Rennen im schnellwachsenden 1 Mrd.
US$-Next-Gen-Sequencing-Markt macht, ist
nicht zuletzt durch Roches 5,7 Mrd. US$-Offerte
an Illumina (vgl S. x) nicht abzusehen.
Für einen regelmäßigen Bezug von LABORWELT
ist eine kostenlose Registrierung unter
www.biocom.de oder per Fax erforderlich.
Namentlich gekennzeichnete Beiträge stehen in
der inhaltlichen Verantwortung der Autoren.
Alle Beiträge sind urheberrechtlich geschützt.
Ohne schriftliche Genehmigung des BIOCOM
Verlages darf kein Teil in irgendeiner Form
reproduziert oder mit elektronischen Systemen
verarbeitet, vervielfältigt oder verbreitet werden.
Titelbild: ancroft/iStockphoto
© BIOCOM AG, Berlin
BIOCOM AG
Inserentenverzeichnis
BIOCOM AG ........................19, 22, 27
CRELUX GmbH ......................Beilage
Dunn Labortechnik GmbH .............. 21
European Biotechnology Foundation 13, 16
Fördergesellschaft IZB mbH. ............ U3
Life Science Austria LISA/BOB ........... U2
New England Biolabs GmbH ............ U4
Particular GmbH ........................ 7
Porvair Science Ltd. ...................... 19
Toso Haas . .............................. 11
Vorschau Heft 2/2012
Themen
Laborautomation & Aktuelles
Jüngste Fortschritte in der Laborautomation
sowie zwei weitere, aktuell ausgewählte
Themen stehen im Mittelpunkt
der nächsten Printausgabe von LABOR-
WELT (Erscheinungsdatum 21. Juni 2012).
Bereits zuvor wird ein Teil der Beiträge,
Expertenpanels und Top-Publikationen
auf der völlig überarbeiteten Online-Plattform
LABORWELT.de veröffentlicht werden.
Für das LABORWELT-Hauptthema „Laborautomation“
sind die Themen „Biobanking
& Biomarkers: Präparation, Probenlagerung
und Analyse“, Drug Discovery Automation:
„Zellbasierte Assays, Liquid Handling und
Detektion“ sowie „Mikrofluidik/Omics-
Automation“ geplant. Bei Interesse, einen
Beitrag beizusteuern, hilft die Redaktion
(Tel.: 03026492150, E-Mail: t.gabrielczyk@
biocom.de) gerne weiter.
Expertenpanel Klinische Diagnostik
Werbekunden bietet diese Ausgabe eine
opti male Plattform für ihre Produkt-und
Image anzeigen. Reservieren Sie Ihren Werbeplatz
in der LABORWELT-Themenausgabe
bis spätestens zum 8. Juni 2012. Ergänzend
zum Thema „Laborautomation“ lassen wir
Automations- und Diagnostikexperten
zu aktuellen Entwicklungen im Anwendungsfeld
„Automation in der klinischen
Diagnostik“ zu Wort kommen. Informationen
zur möglichen Teilnahme einer Ihrer
Experten sowie über die aktuellen Themen
gibt Oliver Schnell (Tel.: +49-30-264921-45,
E-Mail: o.schnell@biocom.de).
42 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT

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Ihr Vorteil:
4 Nur 1 Puffer für über 200 Enzyme:
Für 177 NEB Standard Enzyme sowie alle 26 HF Enzyme
garantiert der NEBuffer 4 eine 100% Aktivität im Einzel- oder
Doppelverdau
C Flexible Reaktionszeiten:
Einsetzbar vom Time-Saver Verdau in nur 5 - 15 min
bis zum Übernachtverdau
E HF Enzyme - Engineered for Performance!
R Dramatisch reduzierte Star Aktivität:
HF Enzyme mit bis zu 62.500-fach erhöhter Genauigkeit
Günstiger Preis
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