vsao Journal Nr. 4 - August 2022

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Perspektiven namentlich die bereits erwähnten Helicobacter-Bakterien, die morphologisch eindeutig nachgewiesen werden können. Andere Beispiele sind die intestinale Spirochätose oder Aktinomyzes-Drusen. Grundsätzlich sind auch Spezialfärbungen möglich, namentlich eine Gramfärbung, welche eine Unterscheidung zwischen grampositiven und gramnegativen Bakterien erlaubt, die Unterscheidung allerdings und die Spezifi zierung v. a. der gramnegativen Bakterien, ist schwierig. Selbstverständlich kommen auch Spezialfärbungen zum Einsatz, namentlich die modifizierte Ziehl-Neelson Färbung für Mykobakterien. Bei der Tuberkulose sind allerdings meistens nur wenige Keime vorhanden und der Nachweis ist wenig zuverlässig, hier haben Spezialuntersuchungen wie die PCR heute eine wichtige Funktion. Dem gegenüber sind Pilze häufig gut erkennbar, v. a. die Fadenpilze wie Aspergillus oder Mucorales, allerdings sollten hier Zusatzfärbungen wie die PAS-Färbungen oder Versilberungen (z. B. Groccott) zur Anwendung kommen (Abbildung 1). Die Morphologie, unterteilt nach Hefen oder Fadenpilzen, erlaubt durchaus eine Einteilung, die Subspezies ist allerdings morphologisch häufig nicht mit Sicherheit diagnos tizierbar. Dazu kommen v. a. bei Nekrosen degenerative Veränderungen, welche die morphologische Beurteilung zusätzlich erschweren. Parasiten wie Protozoen oder Helminthen sind in der Histologie meistens gut und erkennbar und zu diagnostizieren. Die Form erlaubt häufig eine Diagnose, allerdings ist hier der fokale Befall zu berücksichtigen und Stufenschnitte sind notwendig, die Erreger nachzuweisen. Die kleinsten Erreger schliesslich, die Viren, entziehen sich grundsätzlich der Visualisierung durch das Lichtmikroskop, da sie aber obligat intrazelluläre Keime sind, welche häufig zu sekundären Zellveränderungen führen (zytopathogener Effekt) lassen sich Viruserkrankungen zum Teil sehr gut und genau diagnostizieren. Dazu gehören die Herpesviren, namentlich Herpes simplex oder zoster, die Infektion mit dem humanen Papilloma-Virus (HPV), aber auch andere wie z. B. Parvoviren. Die wichtigste und die am besten etablierte Technik zum Nachweis von Erregern am Gewebe, welche gleichzeitig erlaubt, die Morphologie zu beurteilen, ist die Immunhistochemie. Es gibt eine, allerdings begrenzte, Reihe von kommerziell erhält lichen Antikörpern, welche am formalinfixierten und in Paraffin eingebetteten Material verwendet 38 Abbildung 4. Ausschnitt aus der Histologie eines Condyloma lata: A. Hyperkeratose und chronisch-aktive Entzündung (H&E Färbung). B: Immunhistochemische Darstellung von Treponema pallidum, typischerweise entlang den Desmosomen der Plattenepithelien (rot). werden können. Bewährt haben sich Antikörper gegen die gängigen Viren wie Herpes simplex, Hepatitis B oder Varizellen, für andere Erreger gibt es nach wie vor keine zuverlässigen Antikörper (z. B. Hepatitis C), nicht zuletzt, weil ein Markt für diese Reagenzien relativ klein ist. Auch für gewisse Bakterien gibt es gut funktionierende Antikörper, namentlich für Treponemen (erfasst Spirochäten und T. pallidum) oder für Helicobacter (Abbildung 4). Weniger zuverlässig und auch weniger gebräuchlich ist die Immunhistochemie für Pilze, weil diese meistens eine ungenügende Spezifität aufweisen. Kaum erhältlich, da die Morphologie häufig ausreicht, ist die Immunhistochemie für Protozoen oder andere Parasiten. Molekulare Diagnostik und integrierte Diagnose Wie überall in der Pathologie hat sich auch in der Diagnostik von Infektionskrankheiten in den letzten Jahrzehnten die molekulare Diagnostik als wichtige Zusatzuntersuchung etabliert. Wegen der hohen Empfindlichkeit haben sich v. a. PCR-Untersuchungen zum Nachweis von Erreger Nukleinsäure, v. a. von DNA und in geringem Ausmass auch von RNA, durchgesetzt. Das Institut für Pathologie des Kantonsspital Baselland hat in den letzten 20 Jahren mehrere tausend PCR-Untersuchungen für Erreger durchgeführt, z. B. mit der Frage nach Mykobakterien, aber auch einer Reihe andere Erreger welche zum Teil schwierig oder nicht züchtbar sind wie Tropheryma whipplei, Treponema pallidum oder M. leprae. Ebenfalls mit der PCR wurde die oben aufgeführte Tularämie bestätigt. Dabei kommt ein weiterer Vorteil der Pathologie zum Tragen, dass nämlich für die Diagnose keine Anzüchtung der Bakterien notwendig ist, was bei Francisella tularensis erhöhte Sicherheitsvorkehrung erfordert. Ausserdem erlaubt die PCR nicht nur den Nachweis von Erreger-DNA, sondern es ist auch möglich, Untersuchungen auf Resistenz-Gene durchzuführen, z. B. bei Helicobacter-Bakterien. Die Untersuchung am formalinfixierten und in Paraffin eingebetteten Material unterscheidet sich von Analysen anderer Untersuchungsmaterialien. DNA aus paraffineingebettetem Material ist stark fragmentiert (< 250 – 300 Basen paare) und entsprechend müssen alle Essays so ausgerichtet sein, dass diese kurzen Fragmente auch erfasst werden können. Kurze Fragmente haben zusätzlich den Nachteil, dass Sequenzierungen beschränkt möglich sind und entsprechend auch die Subtypisierungen nicht immer abschliessend möglich sind. Gleichzeitig ist es sehr wichtig, dass strengste Vorsichtsmassnahmen getroffen werden, um Kontamination von vorgehenden Untersuchungen und damit falsch positive Resultate zu vermeiden. 4/22 vsao /asmac Journal
Perspektiven Schliesslich ist das molekulare Resultat immer auch mit dem morphologischen Befund zu korrelieren und abweichende oder nicht erklärbare Resultate sind zu re-evaluieren. Als weiteres Beispiel der molekularen Untersuchungen sei die PCR mit anschliessender Sequenzierung für humanpathogene Pilze erwähnt. Pilze lassen sich zwar morphologisch einordnen, die genaue Diagnose ist allerdings häufig schwierig. Je nach klinischer Situation, z. B. bei Mucor, ist es bedeutsam, eine schnelle und eindeutige Diagnose zu stellen; kann doch eine Infektion mit Mucor bei immunsupprimierten Patienten schnell fortschreiten oder sogar tödlich enden. Ausserdem kann die Anzucht der Pilze aus nativem Material mehrere Wochen dauern, bis ein abschliessendes Resultat vorliegt. Ein schnelleres Ergebnis kann die Molekularpathologie mittels der PCR und anschliessender Sanger-Sequenzierung bieten, zusätzlich erlaubt diese Technik auch die Erkennung von Mehrfachinfekten [6]. Bereits 2011 wurde die ITS (internal transcribed Spacer) Region in der ribosomalen DNA als universeller Barcode für die Identifizierung von Pilzen angesehen. Diese enthält neben konservierten Regionen viele variable Bereiche, die es ermöglicht Pilze inter- und intraspezifisch zu identifizieren [7]. Im Gegensatz zur Array-Methode, die nur definierte Pilzspezies identifiziert, ist das System der PCR mit degenerierten Primern ergebnisoffen. Dadurch können neben bekannten Arten wie Aspergillus sp., Trichophyton sp. und Candida sp. auch seltenere humanpathogene Spezies wie Exophiala jeanselmei, Coccoidioides immitis oder Cladophialophora bantiana nachgewiesen werden (Abbildung 1B) [8]. Die Identifizierung der Pilze mittels PCR am Institut für Pathologie des KSBL ist für Paraffinmaterial (FFPE) etabliert, das heisst, eine Diagnose ist auch noch möglich, wenn kein natives Material mehr zur Verfügung steht. Zukünftige Entwicklungen In Zukunft muss mit einer Zunahme von komplexen Infektionen gerechnet werden. Ursache dafür sind vermehrt Patienten mit Immunsuppression, sei es iatrogen medikamentös, aber auch durch die nach wie vor bestehende HIV-Infektion und die zunehmend älter werdende Bevölkerung. Dazu muss durch Migration und Flüchtlingsbewegungen, aber auch durch die klimatischen Veränderungen oder die rasante Entwicklung von Antibiotikaresistenzen vermehrt mit ungewöhnlichen und «exotischen» Infektionen gerechnet werden. Bei der Fixation mit Formalin und der anschliessenden Einbettung in Paraffin, werden sowohl die Gewebezellen als auch die Erreger in der Probe abgetötet. Ausserdem führt die Behandlung mit Formalin zur erwähnten Fragmentierung der Chromosomen und zur Bildung von Querverbindungen zwischen einzelnen DNA Fragmenten. Wegen dieser Vorbehandlung können in der Pathologie gewisse Untersuchungen wie z. B. die Massenspektrometrie-basierte Identifikation der Krankheitserreger (MALDI-TOF) nicht durchgeführt werden. Andererseits erlaubt das fixierte Material auch retrospektive Untersuchungen an archiviertem Material durchzuführen. Die PCR erlaubt relativ gut, einzelne Erreger in den Gewebsproben nachzuweisen. Der Nachteil dieser PCR-Tests ist, dass jeder Test für sich nur eine bestimmte Erregerspezies nachweisen kann. Bei histologischem Verdacht aber fehlendem Erregernachweis wäre ein breiterer, ergebnisoffener Ansatz von Vorteil. Eine Lösung für dieses Problem sind PCR-Tests, die auf Zusammenfassung ein Gen abzielen, das in allen Bakterien gleichermassen vorhanden ist das 16S rRNA Gen. Als Teil der Genkassette, die die Ribosomen codiert, ist es in jedem Bakterium vertreten. Ausserdem kann anhand der genauen DNA Sequenz des Gens die Spezies des Bakteriums ermittelt werden. Allerdings gilt hier: Je länger die analysierte DNA Sequenz ist, desto verlässlicher die Speziesbestimmung. Erneut macht in der Infektionspathologie hier die Probenverarbeitung einen Strich durch die Rechnung: DNA aus FFPE Proben ist selten lang genug um diese PCR-Tests erfolgreich einsetzen zu können. Diese Lücke kann durch Next Generation Sequencing (NGS) Technologie, auch Tiefensequenzierung genannt, geschlossen werden: In sogenannten Metagenomics NGS Tests wird die DNA Sequenz vieler kurzer Fragmente gelesen und zusammengesetzt um für eine verlässliche Speziesidentifikation zu sorgen. Weil diese Tests so entworfen sind, dass sie alle der bekannten Bakterienspezies detektieren können (aktuell über 400 000), ist die Validierung der Tests für die klinische Anwendung äusserst aufwändig. Aber die NGS Technologie kann mehr: So lassen Die gewebebasierte histopathologische und molekularpathologische Diagnostik von Infektionskrankheiten ist ein sehr spannendes interdisziplinäres Feld, das in der Wahrnehmung nicht nur der fachfremden Kolleginnen und Kollegen manchmal etwas im Schatten der Tumordiagnostik steht. Die Stärke der Pathologie im Bereich der Infektionsdia gnostik liegt jedoch in der Korrelation von Entzündungsmustern und dem direkten Erregernachweis. Zudem erlauben entsprechende Untersuchungen am Gewebe häufig eine rasche Diagnose, und Zusatzuntersuchungen, wie Immunhistochemie oder molekulare Pathologie, ermöglichen einen schnellen Erregernachweis mit einer hohen Sensitivität und Spezifität. Des Weiteren erlaubt die molekulare Untersuchung den Nachweis von Erregern, welche schwierig, gefährlich oder überhaupt nicht zu züchten sind. Es ist davon auszugehen, dass komplexe Infektionskrankheiten durch iatrogene Interventionen, Migration, Antibiotikaresistenz und Klimaveränderungen zunehmen werden und die Pathologie in enger Zusammenarbeit mit den behandelnden Kolleginnen und Kollegen hier weiterhin und zunehmend eine wichtige Aufgabe in der Betreuung der Patientinnen und Patienten wahrnehmen wird. Abstract: Pathology of infectious diseases The pathology of infectious diseases is an exciting interdisciplinary field, despite its niche existence that is somewhat overshadowed by tumor diagnostics. However, the strength of pathology lies in the correlation of the inflammatory patterns and pathogen detection. Moreover, corresponding tissue investigations often allow a rapid diagnosis of the disease, and additional investigations, such as immunohistochemistry or molecular pathology, enable a rapid pathogen characterization with a high sensitivity and specificity. In addition, the molecular analysis allows the detection of pathogens that are difficult, dangerous or not at all to breed. It can be assumed that complex infectious diseases will increase due to iatrogenic interventions, migration, antibiotic resistance and climate change, and that pathology, in close cooperation with its treating colleagues, will increasingly play an important role in the care of patients. vsao /asmac Journal 4/22 39
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