PDF Download - Laborwelt
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petitiv durch intrazelluläres cAMP ersetzt, kann aufgrund der großen<br />
Distanz zwischen Donor und Akzeptor kein Chemilumineszenzsignal<br />
entstehen. Die enzymatische Methode der Firma DiscoveRx basiert auf<br />
cAMP-Molekülen, die mit inaktiven β-Galaktosidase-Komponenten<br />
konjugiert sind. Diese Moleküle werden durch anti-cAMP-Antikörper<br />
gebunden. Intrazelluläres cAMP verdrängt die konjugierten cAMPs,<br />
die nun mit zugegebenen Enzymuntereinheiten aktive β-Galaktosidasen<br />
bilden. Die enzymatische Aktivität kann mit entsprechenden<br />
Fluoreszenz- oder Lumineszenz-Substraten gemessen werden. Die<br />
Firma Meso Scale Discovery hat ein Elektrochemilumineszenz-System<br />
entwickelt, bei dem cAMP mit einem Ruthenium-Derivat konjugiert<br />
ist. Dieses ist an anti-cAMP- Antikörper gebunden, die an Carbonelektroden<br />
angebracht sind. Nach Zugabe eines chemischen Substrates<br />
und einer elektrischen Stimulation wird in einer elektrochemischen<br />
Reaktion Licht erzeugt. Verdrängung durch intrazelluläres cAMP<br />
erhöht die Distanz der konjugierten cAMPs zu den Elektroden und<br />
verhindert die Erzeugung des Lichtsignals 8 .<br />
Allen der oben genannten Assays ist gemein, daß sie auf die Detektion<br />
eines second messenger limitiert sind. Radioaktive Methoden für das<br />
Screening von GPCRs haben den Vorteil, daß sie sehr sensitiv sind.<br />
Will man sich auf die Detektion von IPs festlegen, so ist eine nicht-radioaktive<br />
Methode wie der IP1 -Assay von Cisbio zu empfehlen. Hier<br />
sollte allerdings berücksichtigt werden, daß der Readout nicht zu allen<br />
Readertypen kompatibel ist. Zur Detektion von Ca 2+ ist zu sagen, daß<br />
die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen die potentielle Gefahr<br />
einer unspezifischen Lokalisation des Farbstoffes birgt. Aufgrund der<br />
höheren Sensitivität ist die Aequorin-Methode klar im Vorteil. Für die<br />
Validierung von Orphan GPCRs ist die FLIPR ® -Methode ein in der<br />
Praxis oft genutztes Verfahren. Beide Methoden der Ca 2+ -Messung sind<br />
jedoch sehr zeitaufwendig und sind für das Screening von inversen<br />
Agonisten nicht geeignet 2 . Wird die Messung von cAMP favorisiert, so<br />
muß beachtet werden, daß das radioaktive FlashPlate -System und die<br />
Fluoreszenzpolarisations-Methode nur eine geringe Nachweisgrenze<br />
von 50-100 fmol cAMP pro Well haben. Dagegen sind bei dem HTRFcAMP-Assay<br />
von Cisbio, beim AlphaScreen , bei der enzymatischen<br />
Methode von DiscoveRx und beim Elektrochemilumineszenz-System<br />
von Meso Scale Discovery Detektionsbereiche von weniger als 10 fmol<br />
cAMP pro Well möglich 8 . Der AlphaScreen -Assay hat den Nachteil,<br />
daß er licht- und temperaturempfindlich ist und einem Quenching<br />
durch grüne und blaue Wirkstoffe aus Substanzbibliotheken unterliegt<br />
11 . Aufgrund der Sensitivität und der geringen Wechselwirkung mit<br />
Wirkstoffen aus Substanzbibliotheken haben der HTRF cAMP Assay<br />
von Cisbio und AlphaScreen von Perkin Elmer deutliche Vorteile<br />
gegenüber den anderen Methoden für die cAMP-Messung.<br />
GPCR-Screening mit Reportergenen<br />
All diese Einschränkungen lassen sich durch die Verwendung von<br />
Reportergen-Assays umgehen. Die Methode ist kostengünstig, miniaturisierbar<br />
und als Plattform offen für die Messung aller im GPCR-Signalweg<br />
beteiligten second messenger. Eine Vielzahl von Reportergenen<br />
wurde für die Analyse von GPCRs verwendet, darunter β-Galaktosidase,<br />
green fluorescent protein (GFP) und Luciferase 8 . Die Veränderung<br />
der intrazellulären Ca 2+ - und cAMP-Konzentration wird über die<br />
Aktivität der Reportergene gemessen. Dabei erfolgt die Steuerung der<br />
Expression über die Promotoren des ‚nuclear factor of activated T cells<br />
response element‘ (NFAT-RE) und ‚cAMP response element‘ (CRE). Die<br />
Rezeptor-vermittelte Akkumulation von cAMP führt zur Aktivierung<br />
des Transkriptionsfaktors CRE binding protein (CREB), der über CRE<br />
die Expression des Reportergens hochreguliert. Ist die intrazelluläre<br />
Ca 2+ -Konzentration durch Stimulation des GPCR-Rezeptors erhöht, so<br />
wird der Transkriptionsfaktor NFAT aktiviert, der über die Bindung an<br />
NFAT-RE die Transkription des Reportergens einschaltet. Auf diese Wei-<br />
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EGT_pub <strong>Laborwelt</strong>2006 7/02/06 9:06 Page 1<br />
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LABORWELT 7. Jahrgang | Nr. 4/2006 | 25<br />
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