PDF Download - Laborwelt

Auch hier ermöglicht das Bandenmuster eine
Aussage über die Anzahl der ursprünglich
methylierten Cytosine, da nur bei diesen
das Motiv so erhalten bleibt; aus dem nicht
methylierten Tetranukleotid wird das Motiv
TGTG, welches BstUI nicht erkennt. Wesentlich
genauer, aber auch aufwendiger und
kostenintensiver ist die Klonierung des zu
untersuchenden Fragments und die anschließende
Sequenzierung einiger Klone.
Eine methodische Erleichterung ergibt sich
durch die Anwendung von methylierungssensitiven
Microarrays. In jüngerer Zeit wurde
eine Reihe von Methoden entwickelt, um den
Methylierungsstatus genomischer DNA speziell
aus Tumoren mit Hilfe von Microarrays zu
erfassen. Aufgrund der mangelnden Flexibilität
der Untersuchungsmethoden konnten jedoch
nur wenige CpG-Inseln in einigen Genen
untersucht werden. Als limitierend erwiesen
sich besonders der große Zeitaufwand und die
hohen Kosten, wenn mit einer großen Anzahl
von Sonden gearbeitet werden soll. Dies ist
immer dann der Fall, wenn Sonden für eine
neue Fragestellung hergestellt und validiert
werden sollen.
Um diese Limitierungen zu überwinden,
wurde in dem hier beschriebenen neuen
Ansatz mit dem flexiblen Microarraysystem
Geniom der Febit Biotech GmbH gearbeitet
(Abb.1). Geniom besteht aus einem Oligonukleotid-Synthesizer,
der in einer lichtinduzierten,
maskenfreien Synthese in situ mehr
als 6.700 unterschiedliche Oligonukleotide
parallel in jeweils acht Microarrays synthetisiert
(erweiterbar auf 15.000 Oligos pro
Array). Diese sind jeweils auf einem Biochip
untergebracht und können unabhängig voneinander
hybridisiert werden. Der komplette
Synthesevorgang dauert wenige Stunden.
Auch die Hybridisierung, Detektion und
Kennziffer 24 LW 04 · www.biocom.de �
Datenanalyse lassen sich mit GENIOM einfach
durchführen. Dadurch, daß der gesamte
Prozeß auf einem Gerät im eigenen Labor abläuft,
sind schnelle Optimierungen des Arraydesigns
möglich. Somit werden die eben erst
gewonnenen Erkenntnisse bereits innerhalb
weniger Stunden in Form eines neuen Arrays
mit optimierter Oligonukleotid-Zusammensetzung
umgesetzt. Geniom eignet sich daher
hervorragend für neue Fragestellungen oder
auch die Arbeit mit selten untersuchten Organismen,
für die keine anderen Microarrays
erhältlich sind.
Analyse der CpG-Methylierung eines
Tumorsuppressorgens
Mit Hilfe von Geniom ist es gelungen, beispielhaft
den Methylierungsstatus der CpG-Insel
in der Promotorregion des p16 INK4A -Tumorsuppressorgens
aufzuklären 4 . Diese beinhaltet
bei einer Länge von etwa 650 Nukleotiden
53 CpG-Dinukleotide. Die Expression des
kodierten CDK-Inhibitors 2A wird bei vielen
Tumortypen durch die CpG-Methylierung
inhibiert. Nach Eingabe der Sequenzdaten,
die die einzelnen zu untersuchenden CpGs
beinhalten, errechnet die Geniom ® -Software,
welche Oligonukleotide für deren Detektion
synthetisiert werden müssen. Die Herausforderung
an das Design von spezifischen Proben
besteht bei CpG-Inseln darin, daß die Sequenzen,
in welche die Dinukleotide eingebettet
sind, eine geringe Komplexität aufweisen und
daß die einzelnen CpGs teilweise so nahe beieinander
liegen, daß der Methylierungsgrad
von jeweils mehreren CpGs mit einem Satz
von permutierten Oligos detektiert werden
DASGIP –
Parallel
Bioreactors
for Unparalleled
Results
Abb. 3: Eichkurven zur Auswahl der spezifischsten Sonden (aus [1]). Aufgetragen ist jeweils das
Verhältnis der Intensitäten der Sonde für die methylierte DNA, dividiert durch die für methylierte
plus unmethylierte DNA. Die idealen Werte liegen bei 1; 0.5 und 0. Es wurden nur Sonden weiterverwendet,
die über 0.8 liegen (bei idealem Wert von 1), unter 0.2 liegen (bei idealem Wert von 0)
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bzw. zwischen 0.4 und 0.6 (bei idealem Wert von 0.5).
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7. Jahrgang | Nr. 2/2005 | 33