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A B B L I T Z L I C H T Abb. 4: Methylierungsgrad der p16-CpG-Insel bei verschiedenen kultivierten Zellen (A). Die gemessenen Werte bestätigen die mit methylierungsspezifischer PCR (B) und COBRA festgestellten Tendenzen [aus [3] verändert). muß (jeweils Strang- und Gegenstrang). In Abbildung 2 ist ein Beispiel für das Design von Oligo-Sonden dargestellt, die den Methylierungsstatus dreier CpGs abfragen. Für die Analyse der insgesamt 53 CpGs in der p16- Promotorregion wurden mehrere Replikas von 876 unterschiedlichen Oligos auf einem Microarray synthetisiert. Um die Spezifität der synthetisierten Sonden zu überprüfen, wurden drei dieser identischen Microarrays mit amplifizierter DNA aus der CpG-Insel der p16-Promotorregion hybridisiert, die komplett unmethyliert war, in vitro komplett methyliert worden war beziehungsweise mit einer 50 zu 50-Mischung aus beiden. Nach Farbmarkierung und Detektion wurden aus den jeweils gemessenen Intensitäten Eichkurven errechnet (Abb. 3) A B C und über dafür definierte Qualitätsparameter die Proben mit der höchsten Spezifität für die weiteren Untersuchungen selektiert 3 . Unter Verwendung der so selektierten, hochspezifischen Proben konnte dann der Methylierungsgrad der CpG-Insel im p16-Promotorbereich verschiedener kultivierter Zellen bestimmt werden 3 (siehe Abb. 4A). Es ergaben sich Werte für den Methylierungsgrad von 65% (SW480-Zellen), 40% (HCT116-Zellen) und 22% (SW 48-Zellen). Die Unterschiede in den Methylierungsniveaus der verschiedenen Zelltypen wurden durch die oben beschriebenen, bisulfitbasierenden Methoden bestätigt (siehe Abb. 4B). Auch die eindeutige Identifizierung von einem einzelnen in vitro methylierten Cytosin, in einer Umgebung von nicht methylierten CpGs wurde mit dem hier vorgestellten Ansatz gezeigt 3 . Die bakterielle Methylase M. HpaII methyliert selektiv das Cytosin an der Position 809, während die benachbarten Cytosine 812 und 815 nicht modifiziert werden. Mit den verschiedenen degenerierten Oligonukleotidsonden läßt sich diese selektive Methylierung eindeutig belegen (siehe Abb. 5A). In einem weiteren Schritt wurden Proben von Prostatakarzinompatienten untersucht, wobei jeweils Tumorgewebe mit benachbartem gesunden Gewebe verglichen wurde. In Abbildung 5b wird das zwischen Tumorzellen und gesunden Zellen deutlich abweichende Methylierungsmuster bei den untersuchten 16 CpGs aus der CpG-Insel der Promotorregion des p16 INK4A -Tumorsuppressorgens sichtbar. Während bei dem untersuchten Patienten die Tumorzellen eine Reihe von CpGs mit Methylierungen aufweisen, finden sich in den gesunden Kontrollzellen weniger Methylierungen und zwar bei anderen Cytosinen 4 . Durch Ausdehnung dieser Untersuchungen auf CpG-Inseln anderer Gene, die für das Entstehen von Tumoren relevant sind, ließe sich ein Instrument schaffen, das ergänzende Informationen zur Diagnostik oder zum Therapieverlauf von Krebs beisteuern könnte, indem es die epigenetischen Effekte berücksichtigt, die beim Tumorgeschehen eine Rolle spielen. Die Herausforderung besteht darin, viele dieser relevanten CpG-Inseln gleichzeitig auf einem Microarray zu analysieren. Literatur [1] Falls J.G., Pulford, D.J., Wylie, A.A., Jirtle, R.L. Am. J. Pathol. 154(3), 635-647 [2] Baum, M. et al., Nucleic Acids Research 33(23), (2003) e151 [3] Mund, C., Beier, V., Bewerunge, P., Dahms, M., Lyko, F., Hoheisel, J.D., Nucleic Acids Research 33(8), (2005), e73 [4] Mund, C. persönliche Mitteilung Korrespondenzadresse Dr. Ramón Enríquez Schäfer Febit Biotech GmbH Im Neuenheimer Feld 519 D-69120 Heidelberg eMail: ramon.enriquez-schaefer@febit.de Abb. 5: A. Selektive Identifikation des in vitro methylierten Cytosins 809, mit degenerierten Oligonukleotidsonden (aus [3]) B. Methylierungsmuster der Cytosinnukleotide in der CpG-Insel von p16 4 . Die Höhe der Balken entspricht dem Methylierungsgrad. 34 | 7. Jahrgang | Nr. 4/2006 LABORWELT
Studie � Auswahlkriterien für Durchflußzytometer Bill Kelly, BioInformatics LLC, Arlington, USA Seit den späten siebziger Jahren ermöglicht die Durchflußzytomtrie die Analyse verschiedenster Zelltypen. Die Optik der Flußzytometer unterscheidet Zellen auf Basis ihrer Größe und Form und eröffnet darüber hinaus die Analyse von Molekülen auf deren Oberfläche oder im Zellinneren. Weil es entsprechende Instrumente in zahlreichen Konfiguration und Preisklassen gibt, haben Wissenschaftler zahlreiche Faktoren bei ihrer Entscheidung für eine Marke oder ein ‘Outsourcen’, zu berücksichtigen. Bioinformatics LLC (www.gene2drug.com) hat mehr als 750 Forscher dazu befragt, welche Technik sie einsetzen, um ihre Forschungsziele zu erreichen. Die Ergebnisse sind in der neuen Studie ‘Influencing Brand Preferences in the Flow Cytometry Market’ dokumentiert (b.kelly@gene2drug.com). Stärken der Durchflußzytometrie liegen in der Flexibilität und Sensitivität der eingesetzten Fluoreszenztechnologie in Kombination mit der Schnelligkeit und Möglichkeit zur Datenintegration, die zahlreiche Anwendungen ermöglichen (vgl. Abb). Dabei ist die Zellsortierung die am meisten genutzte Applikation, gefolgt von Studien zur Apoptose, des Zellzyklus und der Detektion fluoreszenter Proteine. Gleichwohl nutzen die Forscher eher Zellanalysatoren als Zellsortierer. Rund 60% der Befragten nutzen zentralisierte Durchflußzytometer-Services. Die Auswahl der Instrumente erfolgt interessanterweise primär entsprechend der Reputation der Marke am Markt. Faktoren wie die Leistungsfähigkeit, der Preis etc. scheinen danach nachgeordnet. BD Biosciences-Geräte sind die meistgenutzte Zytometer-Marke (vgl. S. 36, 39). Unabhängig von der genutzten Marke äußern sich aber die meisten Nutzer unzufrieden mit der Kapazität der Geräte, auch seltene Ereignisse zu erfassen oder messen. Nutzer der Geräteplattformen von BD Biosciences, Beckman Coulter, and Dako (vgl. S. 40) zeigen eine starke Präferenz für Durchflußzytometrie-Reagenzien dieser Unternehmen. Allgemein zählen Reagenzien von BD Biosciences Immunocytomery Systems, BD Biosciences Pharmingen und Molecular Probes zur den Marktführern im Zytometrie-Markt. M A R K T Ü B E R S I C H T Kennziffer 25 LW 04 · Informationen ordern? · www.biocom.de � �� LABORWELT 7. Jahrgang | Nr. 4/2006 | 35 � � 2nd International Congress on Regenerative Biology and 2nd International Congress on Bio-Nano-Interface October 9 – 11, 2006 Liederhalle Cultural & Congress Centre Stuttgart, Germany Register now! Deadline: September 18, 2006 www.biostar-congress.de © Fraunhofer IGB Contact: Ruth Lamprecht Tel.: +49 (0)711 2027-765 Fax: +49 (0)711 2027-766 ruth.lamprecht@ congress-stuttgart.de Organiser: � ��
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