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B L I T Z L I C H T
Abb. 4: Methylierungsgrad der p16-CpG-Insel bei verschiedenen kultivierten Zellen (A). Die gemessenen
Werte bestätigen die mit methylierungsspezifischer PCR (B) und COBRA festgestellten
Tendenzen [aus [3] verändert).
muß (jeweils Strang- und Gegenstrang). In
Abbildung 2 ist ein Beispiel für das Design
von Oligo-Sonden dargestellt, die den Methylierungsstatus
dreier CpGs abfragen. Für die
Analyse der insgesamt 53 CpGs in der p16-
Promotorregion wurden mehrere Replikas
von 876 unterschiedlichen Oligos auf einem
Microarray synthetisiert.
Um die Spezifität der synthetisierten Sonden
zu überprüfen, wurden drei dieser identischen
Microarrays mit amplifizierter DNA
aus der CpG-Insel der p16-Promotorregion
hybridisiert, die komplett unmethyliert war,
in vitro komplett methyliert worden war beziehungsweise
mit einer 50 zu 50-Mischung
aus beiden. Nach Farbmarkierung und Detektion
wurden aus den jeweils gemessenen
Intensitäten Eichkurven errechnet (Abb. 3)
A B
C
und über dafür definierte Qualitätsparameter
die Proben mit der höchsten Spezifität für die
weiteren Untersuchungen selektiert 3 . Unter
Verwendung der so selektierten, hochspezifischen
Proben konnte dann der Methylierungsgrad
der CpG-Insel im p16-Promotorbereich
verschiedener kultivierter Zellen bestimmt
werden 3 (siehe Abb. 4A). Es ergaben
sich Werte für den Methylierungsgrad von
65% (SW480-Zellen), 40% (HCT116-Zellen)
und 22% (SW 48-Zellen). Die Unterschiede
in den Methylierungsniveaus der verschiedenen
Zelltypen wurden durch die oben
beschriebenen, bisulfitbasierenden Methoden
bestätigt (siehe Abb. 4B).
Auch die eindeutige Identifizierung von einem
einzelnen in vitro methylierten Cytosin,
in einer Umgebung von nicht methylierten
CpGs wurde mit dem hier vorgestellten
Ansatz gezeigt 3 . Die bakterielle Methylase
M. HpaII methyliert selektiv das Cytosin an
der Position 809, während die benachbarten
Cytosine 812 und 815 nicht modifiziert werden.
Mit den verschiedenen degenerierten
Oligonukleotidsonden läßt sich diese selektive
Methylierung eindeutig belegen (siehe
Abb. 5A).
In einem weiteren Schritt wurden Proben
von Prostatakarzinompatienten untersucht,
wobei jeweils Tumorgewebe mit benachbartem
gesunden Gewebe verglichen wurde. In
Abbildung 5b wird das zwischen Tumorzellen
und gesunden Zellen deutlich abweichende
Methylierungsmuster bei den untersuchten
16 CpGs aus der CpG-Insel der Promotorregion
des p16 INK4A -Tumorsuppressorgens
sichtbar. Während bei dem untersuchten
Patienten die Tumorzellen eine Reihe von
CpGs mit Methylierungen aufweisen, finden
sich in den gesunden Kontrollzellen weniger
Methylierungen und zwar bei anderen
Cytosinen 4 .
Durch Ausdehnung dieser Untersuchungen
auf CpG-Inseln anderer Gene, die für das
Entstehen von Tumoren relevant sind, ließe
sich ein Instrument schaffen, das ergänzende
Informationen zur Diagnostik oder zum
Therapieverlauf von Krebs beisteuern könnte,
indem es die epigenetischen Effekte berücksichtigt,
die beim Tumorgeschehen eine Rolle
spielen. Die Herausforderung besteht darin,
viele dieser relevanten CpG-Inseln gleichzeitig
auf einem Microarray zu analysieren.
Literatur
[1] Falls J.G., Pulford, D.J., Wylie, A.A., Jirtle, R.L. Am. J. Pathol. 154(3), 635-647
[2] Baum, M. et al., Nucleic Acids Research 33(23), (2003) e151
[3] Mund, C., Beier, V., Bewerunge, P., Dahms, M., Lyko, F., Hoheisel, J.D., Nucleic
Acids Research 33(8), (2005), e73
[4] Mund, C. persönliche Mitteilung
Korrespondenzadresse
Dr. Ramón Enríquez Schäfer
Febit Biotech GmbH
Im Neuenheimer Feld 519
D-69120 Heidelberg
eMail: ramon.enriquez-schaefer@febit.de
Abb. 5: A. Selektive Identifikation des in vitro methylierten Cytosins 809, mit degenerierten Oligonukleotidsonden (aus [3]) B. Methylierungsmuster
der Cytosinnukleotide in der CpG-Insel von p16 4 . Die Höhe der Balken entspricht dem Methylierungsgrad.
34 | 7. Jahrgang | Nr. 4/2006 LABORWELT