500nm - TOBIAS-lib - Universität Tübingen
500nm - TOBIAS-lib - Universität Tübingen
500nm - TOBIAS-lib - Universität Tübingen
Sie wollen auch ein ePaper? Erhöhen Sie die Reichweite Ihrer Titel.
YUMPU macht aus Druck-PDFs automatisch weboptimierte ePaper, die Google liebt.
MATERIAL UND METHODEN<br />
Lichttransmission widergibt. Das PRP dagegen bezeichnet vor Zugabe des<br />
Agonisten bzw. des zu untersuchenden Agens den Nullwert der<br />
Lichttransmission. Für je drei aggregometrische Messansätze werden ungefähr<br />
10 ml Citratblut benötigt, was einer gefüllten Monovette entspricht.<br />
Nach Blutabnahme wurden die Citratblutmonovetten 10 min bei<br />
Raumtemperatur mit 210 g ohne Bremsezentrifugiert. Nach Zentrifugation<br />
wurde das plättchenreiche Plasma abgehoben und die Thrombozyten-<br />
konzentration bestimmt. Anschließend wurde der Blutkuchen einschließlich<br />
eines belassenen Überstandes von ungefähr 200 μl erneut zentrifugiert, 10 min<br />
bei Raumtemperatur mit 2560 g und Bremse. 500 μl des im zweiten<br />
Zentrifugationsschritt gewonnenen PPP wurde in die Referenzküvette gegeben.<br />
Das verbliebene PPP wurde zur Verdünnung des PRP auf eine Konzentration<br />
von 200.000 Thrombozyten/μl verwendet. Unter konstanter Rührung mit<br />
1000 rpm durch einen der Messküvette beigefügten Rührfisch wurde nach zwei<br />
Minuten der Plättchenagonist bzw. das zu untersuchende Agens dem PRP<br />
zugegeben und der Kurvenverlauf der nächsten fünf Minuten aufgezeichnet.<br />
Bewirkt die zugegebene Substanz eine Aggregation der Thrombozyten, so lässt<br />
sich dies anhand der ansteigenden Aggregationskurve infolge der<br />
abnehmenden Lichttransmission des PRP feststellen. Die ansteigende<br />
Aggregationskurve kann als Ausdruck der primären, noch reversiblen<br />
Aggregation im weiteren Verlauf entweder wieder zurückgehen (Deaggregation)<br />
oder bei sekundärer irreversibler Aggregation ein Plateau erreichen.<br />
2.2.6 ELISA: GPVI-EMMPRIN-Bindungsversuch<br />
Zunächst wurden die ELISA 96-Loch-Platten jeweils mit 250 nM Fc-EMMPRIN<br />
oder Fc-Kontrollprotein in Puffer zu je 100 μl/Loch beschichtet und über Nacht<br />
bei 4°C stehen gelassen. Nachdem die Löcher danach mit 300 μl/Loch PBS<br />
gewaschen worden waren, wurden sie bei erneut 4°C über Nacht mit 300 μl<br />
Roti-Block pro Loch blockiert. Am nächsten Tag wurden die Löcher einmal mit<br />
300 μl/Loch PBS gewaschen und verschiedene Konzentrationen von<br />
Digoxigenin-gefärbtem Fc-GPVI oder Fc-Kontroll-Protein zugegeben.<br />
32
Change language