500nm - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

MATERIAL UND METHODEN
Die Interaktionen zwischen den untersuchten Proteinen wurden in der Folge für
400 s in einem optischen Zwei-Kanal-Messungssystem (Ibis) analysiert.
Nach Abschluss jedes Bindungsversuches wurde die Sensoroberfläche durch
Inkubation mit 1 M NaCl von verbliebenen Liganden befreit und wieder in ihren
Ausgangszustand überführt (Regeneration).
Die Daten wurden mit einer Kinetik-Berechnungssoftware ausgewertet und die
kinetischen Parameter der entsprechenden Assoziationsphase mittels nicht-
linearer Regressionsanalyse aus den jeweiligen Werten ermittelt.
Alle Messungen wurden am Institut für klinische Pharmakologie der Universität
Ulm unter der Leitung von Herrn Professor Simmet durchgeführt.
2.2.8 Durchflusszytometrie (FACS)
Die FACS-Analyse (fluorescence-activated cell sorting) ist ein Verfahren, das
eine schnelle, sowie objektive Charakterisierung und Zählung von Zellen
unterschiedlichen Typs ermöglicht. Passieren die Zellen den Laserstrahl des
Gerätes, so emittiert jede Zelle ein Streulicht, das durch Zellgröße, Struktur und
Oberflächeneigenschaften der Zellmembran sowie intrazelluläre Bestandteile
beeinflusst wird.
So erlaubt das Vorwärtsstreulicht (Forward Scatter, FSC) eine Aussage über
die relative Zellgröße, das Seitwärtsstreulicht (Side Scatter, SSC)
charakterisiert die Granularität (Größe und Struktur der Zellorganellen) oder die
Oberflächenbeschaffenheit der Zellen. Durch Anfärbung der zu analysierenden
Zellen mit fluoreszierenden Antikörpern lassen sich einzelne Antigene, sowie
Oberflächenstrukturen spezifisch nachweisen und quantifizieren. Entsprechend
fluoreszierende Farbstoffe sind beispielsweise Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)
und Phycoerythrin (PE). Diese werden vom monochromatischen Licht des
Lasers angeregt und in deren spezifischer Wellenlänge emittiert. Die
Fluoreszenz nimmt proportional zur Anzahl der von einer Zelle entsprechend
ihrer Oberflächenantigene spezifisch gebundener farbstoffkonjugierter Anti-
körper zu.
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