500nm - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

2.2.11 Immunhistologie
MATERIAL UND METHODEN
Nach Entparaffinisierung der aus einer Mäuseaorta gewonnen Gefäßschnitte
wurden diese in PBS gewaschen und dreimal fünf Minuten in Citratpuffer
gekocht. Nach einem weiteren Waschschritt mit PBS wurden die Schnitte 15
min in 3%igem Wasserstoffperoxid inkubiert, bevor diese drei mal zwei Minuten
in 0,05%igem Tween-PBS (Tween 20) und anschließend in 15%iges
Kaninchenserum (bei Markierung von EMMPRIN) bzw. 15%iges Eselserum
(bei Markierung von Cyclophilin A) eingelegt wurden.
Nach Abkippen des Überstandes wurden die Gefäßschnitte mit den
entsprechenden Antikörpern gegen CD147 (1 mg/ml; 1:30 in 1% BSA) oder
Cyclophilin A (0,5 mg/ml; 1:100 in 1% BSA) bzw. der IgG1-Kontrolle oder PBS
eine Stunde bei RT inkubiert. Im Anschluss wurden die Schnitte zunächst für
fünf mal fünf Minuten mit 0,05%igemTween-PBS und anschließend für weitere
30 min mit dem entsprechenden biotinylisierten Zweitantikörper inkubiert.
Nachdem die Schnitte erneut fünf mal fünf Minuten in 0,05%iges Tween-PBS
eingelegt worden waren, wurde für 30 min der StreptABComplex/HRP
zugegeben. Vor und nach dem folgenden fünf bis zehn minütigen Bad in DAB-
Lösung wurden die Gefäßschnitte wieder fünfmal fünf Minuten mit 0,05%igem
Tween-PBS inkubiert. Es folgte ein zweiminütiges Gegenfärben mit
Hämalaunlösung, sowie das „Bläuen“ in lauwarmem Leitungswasser für 15 min.
2.2.12 Statistische Analyse
Die gewonnen Daten wurden mittels Student t-Test oder Varianzanalyse auf
ihre statistische Aussagekraft hin untersucht. Angegeben sind die Mittelwerte
mit Standardabweichung. P