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72 WISSENSCHAFTLICHER ERGEBNISBERICHT | Infektion und Immunität | Mikrobielle Pathogenese 01.4 Analyse der Proteinnetzwerke früher Wirt-Pathogen- Interaktionen PROJEKTLEITER | Dr. Lothar Jänsch | Arbeitsgruppe Zelluläre Proteomforschung | lja@helmholtz-hzi.de PROJEKTMITARBEITER | Dr. Uwe Kärst | Dr. Sebastian König | Dr. Manfred Nimtz | Dr. Tobias Reinl | Dr. Josef Wissing | Evelin Berger | Susanne Freund | Christoph Gernert | Alexander Iphöfer | Thorsten Johl | Kirstin Jurrat | Zofi a Magnowska | Maxi Scheiter Fokus der Arbeitsgruppe Zelluläre Proteomforschung ist die Analyse fundamentaler Signaltransduktionsereignisse, die für humanpathogene Infektionsprozesse sowie die Aktivierung und Kontrolle der adaptiven Immunantwort des Wirtes wichtig sind. Zellbiologische, biochemische, massenspektrometrische und bioinformatische Arbeitsmodule werden hierfür entwickelt und kombiniert. Das Ziel: Eine quantitative und zeitaufgelöste Analyse der Expression, Lokalisation, Interaktion und der posttranslationalen Modifi kationen (PTM) von Proteinen in primären und immortalisierten humanen Zellen. Methoden Quantitative und chemische Proteomanalysen erlauben die Identifi zierung zellulärer „Targetproteine“ und die Aufklärung von Signalnetzwerken. Hierzu werden niedermolekulare Moleküle aus der therapeutischen Wirkstoffforschung optimiert und nach einer Immmobilisierung als „Fallen“ für Bindungspartner genutzt. In Kombination mit Chromatographie- und MS-Verfahren können wir transiente Strukturmodifi kationen an Signalkomponenten aufklären. So werden im Fall der Phosphorylierung an Proteinkinasen sowohl deren Aktivitäten als auch die molekularen Interaktionen mit ihren Substratmolekülen koordiniert. Die statistische Auswertung quantitativer Peptiddaten erfolgt mit der iTRAQ-Technologie. Dadurch können wir auch Prozesse in primären humanen Zellen und Geweben quantitativ beobachten. Phosphorylierungsabhängige Signalwege im Invasionsprozess von Listeria monocytogenes Das Bakterium L. monocytogenes verursacht in immunkompromittierten Patienten schwere Erkrankungen sowie vorgeburtliche Infektionen. Die Virulenzfaktoren InlA und InlB induzieren durch Wechselwirkung mit dem Adhäsionsprotein E-Cadherin (InlA) und der Rezeptor-Tyrosinkinase c-Met (InlB) die Invasion der Wirtszelle. Die Signalübertragungswege werden durch Kinase-katalysierte Proteinphosphorylierungen kontrolliert. Durch die Identifi zierung und Quantifi - zierung InlA-abhängiger, phosphorylierter Substratproteine haben wir ein funktionelles Netzwerk von Proteinkinasen im E-Cadherin-Signalweg abgeleitet. Eine direkte Analyse zeitaufgelöster Phosphorylierungsvorgänge an Kinasen konnte weltweit erstmalig am InlB-aktivierten c-Met-Signalweg demonstriert werden. Dabei wurden neue Signalkomponenten der listeriellen Invasion entdeckt, die auch in dem durch HGF kontrollierten physiologischen Met-Signalweg bisher nicht beschrieben wurden. Funktionelle Studien dieser Kinasen analysieren daher sowohl ihren Beitrag zur Invasion als auch ihre Bedeutung für motogene und “Kinasebaum” aller humanen Kinasen, markiert sind die aktuell identifi zierten humanen Kinasen (rot) und deren Orthologe in der Maus. Grafi k: HZI mitogene zellu läre Prozesse. Die entwickelten Verfahren sind auf andere Proteinmodifi kationen übertragbar und werden bereits für die Analyse von Ubiquitinylierungen genutzt. Charakterisierung von Signaltransduktionswegen in aktivierten NK- und T-Zellen T-Lymphozyten sind essenziell für die Regulation des Immunsystems. Ihre zellulären Prozesse und Effektorfunktionen sind dabei unmittelbar vom Aktivierungsstatus der Signalwege abhängig. Quantitative Phosphokinom-Analysen an verschiedenen regulatorischen T-Zellen zeigten neue Komponenten der CD3/ CD28-abhängigen Signalwege auf. Beim Vergleich von CD3/ CD28-induzierten Signalnetzwerken von effektorischen und regulatorischen T-Zellen wurden Expression und Phosphorylierungsstatus von etwa 150 Kinasen untersucht. Es wurden neue Signalkomponenten und Phosphorylierungsstellen in regulatorischen T-Zellen identifi ziert. Sie werden nun hinsichtlich ihrer Rolle zur Bildung und Funktion suppressorischer T-Zellen in Mensch und Maus untersucht. Die an T-Zellen entwickelten Konzepte werden erstmalig auch zur Charakterisierung aktivierter NK-(natural killer) Zellen der angeborenen Immunantwort eingesetzt. Hemmen, K. Reinl, T.; Buttler, K. Behler, F., Dieken, H. Jaensch, L., Wilting, J., Weich, H.A. (2010) High-resolution mass spectrometric analysis of the secretome from mouse lung endothelial progenitor cells. Angiogenesis, in press Reinl T., Nimtz, M., Hundertmark, C., Johl, T., Kéri, G., Wehland, J., Daub, H. and Jänsch, L. (2009) Quantitative phosphokinome analysis of the Met pathway activated by the invasin InlB from Listeria monocytogenes. Molecular Cell Proteomics 8(12):2778-95.
WISSENSCHAFTLICHER ERGEBNISBERICHT | Infektion und Immunität | Mikrobielle Pathogenese 73 01.5 Strukturelle und mechanistische Analyse funktioneller Amyloide PROJEKTLEITERIN | Prof. Dr. Christiane Ritter | Nachwuchgruppe Makromolekulare Interaktionen | cri07@helmholtz-hzi.de PROJEKTMITARBEITER | Agnes Zimmer | Madhu Nagaraj | Johannes Spehr | Tobias Schubeis Amyloide sind geordnete Proteinfasern (sog. Fibrillen), die sowohl mit schweren Krankheiten – durch Proteinfehlfaltung ausgelöst –, als auch mit nützlichen Zellfunktionen zusammenhängen. In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass viele Bakterien fi brilläre Adhäsine ausbilden, die eine Amyloidähnliche Struktur ausbilden. In natürlich vorkommenden bakteriellen Biofi lmen wiesen bis zu 40 % der anwesenden Spezies solche Strukturen auf. Einige von ihnen erhöhen die Virulenz der Bakterien, indem sie z.B. für die Ausbildung von Biofi lmen wichtig sind, Interaktionen mit dem Wirt vermitteln oder die Adaptation an verschiedene Umweltbedingungen erleichtern. Im Gegensatz zu Amyloiden, die mit Krankheiten wie Alzheimer, Parkinson oder den Prion-Erkrankungen assoziiert sind, sind diese funktionalen Amyloide jedoch nicht toxisch. Der Schwerpunkt unserer Forschung liegt auf der Aufklärung der strukturellen und mechanistischen Grundlage dieser Funktionen für ausgewählte bakterielle und pilzliche Amyloide. Instrumente zur Bestimmung der Struktur von Amyloidfi brillen Hochaufl ösende, strukturelle Informationen über natürlich vorkommende Amyloide sind rar, da aufgrund ihrer Größe und nichtkristallinen Struktur etablierte Strukturanalysetechniken nur eingeschränkt nutzbar sind. Daher haben wir eine neue, allgemein anwendbare Methode erarbeitet, bei der die Struktur der Amyloidfi brillen über Kernmagnetresonanz (NMR)-detektierten Wasserstoffaustausch, Festkörper-NMR und weitere spektroskopische Techniken ermittelt werden kann. Festkörper-NMR ist eine neue Methode zur Bestimmung hochaufgelöster Proteinstrukturen mit hohem Potential für fi brilläre Proteine. Wir etablieren diese Methode am HZI und entwickeln biochemische Ansätze zur selektiven Isotopenmarkierung der Proteinproben. Curli: eine Virulenz-verstärkende Amyloidhülle Curli ist die wichtigste Proteinkomponente der extrazellulären Matrix, die Enterobacteriaceae, wie z.B. E. coli und Salmonella typhimurium, produzieren. Curli-Fibrillen sind an der Adhäsion an biotischen und abiotischen Oberfl ächen und an der Bildung von Biofi lmen beteiligt. Ihre Interaktion mit spezifi schen Wirtsproteinen ermöglicht das Eindringen der Bakterien in die Wirtszellen und führt zu Entzündungen und Sepsis. In vivo wird die Fibrillenbildung der Hauptkomponente von Curli, CsgA, exklusiv durch das homologe Protein CsgB initiiert. Um die Funktionalitäten von CsgA und CsgB zu verstehen, analysieren wir die Strukturen, die Kinetik der Fibrillenbildung und die thermodynamische Stabilität der von beiden Proteinen gebildeten Fibrillen. Außerdem untersuchen wir die Struktur und Funktion von Proteinen, extracellular space Modell der Curli-Biogenese. Die Expression der Curli-Untereinheiten wird durch den positiven Transkriptionsregulator CsgD kontrolliert. CsgA ist die strukturelle Hauptkomponente. Um Curli- Fasern bilden zu können, benötigt es das homologe Protein CsgB als Nukleator. CsgG ist ein Membrankanal, der für den Export der Strukturproteine notwendig ist, und CsgE und CsgF sind molekulare Chaperone, die für die korrekte Ausbildung der Curli-Fasern notwendig sind. Die Vergrößerung zeigt ein Modell eines einzelnen CsgA Moleküls innerhalb der fi brillären Curli-Struktur, das basierend auf Wasserstoffaustauschdaten berechnet wurde. die in vivo für die Biogenese von Curli-Fimbrien essenziell sind. Ein mechanistisches Verständnis der Curli-Biogenese wird es erlauben, neue Ansatzpunkte zu identifi zieren, um die Ausbildung dieser Strukturen zu verhindern und so die Virulenz der Bakterien zu reduzieren. HET-s: ein funktionelles Prion aus Fadenpilzen Einige der heute bekannten Amyloide sind in der Lage, sich in vivo selbst zu replizieren und sind somit Prionen (infektiöse Proteine). Um die molekularen Grundlagen für die Infektiösität von Amyloiden zu verstehen, untersuchen wir die biophysikalischen Eigenschaften des funktionellen Prionproteins HET-s aus dem Fadenpilz Podospora anserina, sowie die Eigenschaften eines homologen Proteins aus Fusarium graminearum. Trotz erheblicher Unterschiede in der Aminosäuresequenz sind die Amyloide der beiden Proteine für den jeweils anderen Organismus infektiös, d.h. es besteht keine Speziesbarriere. Mit Hilfe von Wasserstoffaustauschexperimenten konnten wir zeigen, dass dieses Verhalten auf einer hochkonservierten Struktur der Fibrillen beruht. Wasmer, C., Zimmer, A., Sabate, R., Soragni, A., Saupe, S.J., Ritter, C., and Meier, B.H. (2010). Structural Similarity between the Prion Domain of HET-s and a Homologue Can Explain Amyloid Cross-Seeding in Spite of Limited Sequence Identity. Journal of Molecular Biology 402(2): 311-325. Greenwald, J., Buhtz, C., Ritter, C., Kwiatkowski, W., Choe, S., Maddelein, M.L., Ness, F., Cescau, S., Soragni, A., Leitz, D., Saupe, S.J., and Riek, R. (2010). The Mechanism of prion inhibition by HET-S. Molecular Cell 38: 889-899.
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