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76 WISSENSCHAFTLICHER ERGEBNISBERICHT | Infektion und Immunität | Mikrobielle Pathogenese 01.8 Strukturelle Charakterisierung von Faktoren der Pathogenabwehr PROJEKTLEITER | Dr. Konrad Büssow | Arbeitsgruppe Rekombinante Proteinexpression | kbu07@helmholtz-hzi.de PROJEKTMITARBEITER | Sonja Wilke | Sarah Tokarski An der Abwehr von Krankheitserregern nimmt eine Vielzahl von Proteinen teil. Die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur von Proteinen durch Röntgenstrukturanalyse liefert wichtige Informationen über ihre Funktionsweise. Bei vielen menschlichen Proteinen waren Strukturuntersuchungen bisher nicht möglich, weil die Proteine nicht in größeren Mengen rein hergestellt werden konnten. Das ist jedoch die Voraussetzung, um Proteinkristalle zu züchten und Röntgenbeugungsdaten aufzunehmen. Proteine werden für Röntgenstrukturuntersuchungen meistens in Bakterien hergestellt. Die Bakterien werden gentechnisch so verändert, dass sie das jeweilige Zielprotein in großen Mengen produzieren. Das Verfahren ist schnell und preiswert. Allerdings lassen sich viele menschliche Proteine, die an der Abwehr von Krankheitserregern beteiligt sind, so nicht herstellen. In Bakterien werden die notwendigen Prozessierungsschritte nicht ausgeführt, die diese Proteine in ihre biologisch aktive Form überführen. Proteine aus tierischen Zellkulturen Kultivierte tierische Zellen sind bei der Herstellung von Proteinen für die Röntgenstrukturuntersuchung eine Alternative zu Bakterien. Meistens werden Insektenzellen eingesetzt, die mit gentechnisch veränderten Baculoviren infi ziert werden. Aber auch Säugerzelllinien leisten gute Dienste, besonders bei Proteinen, die in ihrer natürlichen Umgebung aus den Zellen ausgeschleust werden und sich in der extrazellulären Flüssigkeit oder auf der Zellaußenseite befi nden. Diese ausgeschleusten Proteine, beispielsweise Antikörper oder Zytokine, sind oftmals durch Disulfi dbrücken stabilisiert und tragen Kohlenhydratketten auf ihrer Oberfl äche. Um sie für die Röntgenstrukturanalyse herzustellen, bietet sich die Hamster-Zelllinie CHO-Lec 3.2.8.1 an. Bei ihr führen Mutationen dazu, dass die Kohlenhydratketten klein und einheitlich ausfallen und die produzierten Proteine deshalb gut kristallisierbar sind. Beschleunigte Zelllinienerzeugung Nachteilig ist, dass die Herstellung einer gentechnisch veränderten CHO-Lec Zell linie nach Standardmethoden ungefähr ein Jahr erfordert. Durch den Einsatz eines neuen Verfahrens konnten wir den Zeitaufwand stark reduzieren. Dieses Verfahren basiert auf einem fl uoreszierenden Reportergen, GFP, das es ermöglicht, gentechnisch veränderte CHO-Lec Zellen mit besonders guten Produktionseigenschaften mit der Fluoreszenz-akti vierten Zellsortierung (FACS) zu separieren und anschließend zu klonieren. Klonierung einer stabilen GFP Zelllinie durch Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung Grafi k: HZI Die Kassettenaustauschtechnologie (RMCE) ermöglicht es, die Herstellung von Produktionszelllinien noch weiter zu beschleunigen. RMCE erlaubt es, über ortsgerichtete Rekombination ein Markergen wie GFP gegen ein beliebiges anderes Gen auszutauschen. Ein Verfahren, das nur wenige Wochen in Anspruch nimmt. Wir haben die Klonierung einer GFP-Zelllinie über Zellsortierung mit RMCE kombiniert und konnten den Kassettenaustausch in CHO-Lec Zellen bereits erfolgreich demonstrieren. Mit dieser Methode haben wir Produktionszellinien für verschiedene Lysosomen-assoziierte Membranproteine (LAMP) hergestellt. Die Zelllinien sekretieren verkürzte LAMP Proteine, denen der Membrananker fehlt. Die LAMPs spielen in den Lysosomen eine wichtige Rolle und sind für Beseitigung von Krankheitserregern durch Phagozytose erforderlich. Verschiedene LAMP Proteine konnten in großen Mengen hergestellt und kristallisiert werden. Zum ersten Mal konnte die räumliche Struktur eines LAMPs ermittelt werden. Allerdings sind weitere Arbeiten nötig, um die Struktur zu verbessern und den molekularen Aufbau dieser wichtigen Proteine im Detail zu verstehen. Wilke,S., Krausze,J., Gossen,M., Gröbe,L., Jager,V., Gherardi,E., van den,H.J., & Bussow,K. (2010) Glycoprotein production for structure analysis with stable, glycosylation mutant CHO cell lines established by fl uorescence-activated cell sorting. Protein Science 19, 1264-1271.
WISSENSCHAFTLICHER ERGEBNISBERICHT | Infektion und Immunität | Mikrobielle Pathogenese 77 01.9 Mykobakterielle Phagosomen und Immunität PROJEKTLEITER | Dr. Maximiliano G. Gutierrez | Nachwuchsgruppe Phagosomen Biologie | mgg08@helmholtz-hzi.de PROJEKTMITARBEITER | Achim Gronow | Bahram Kasmapour | Gang Pei | Dr. Cristina Vazquez M. tuberculosis ist so erfolgreich, weil es in der Lage ist, innerhalb der Phagosomen von Makrophagen zu überleben. M. tuberculosis blockiert die Phagosomreifung, insbesondere die Phase, in der Phagosom und Lysosom fusionieren. Dadurch kann es in den Makrophagen wachsen und trägt zur Ausbildung des pathologischen Zustands bei. Die Mechanismen hinter der blockierten Phagosomreifung durch M. tuberculosis sind noch unklar. Vermutlich wird die Art der Manipulation der intrazellulären Abwehrreaktion durch das Mykobakterium von mehreren Faktoren gesteuert und erfolgt dynamisch. Es wurden verschiedene intrazelluläre Angriffspunkte, wie etwa die Rab-Proteine, in Betracht gezogen. Sie könnten die Blockierung der bakteriziden Funktion einer infi zierten Makrophage erklären. Das zeigt, dass der Eingriff in den intrazellulären Stoffaustausch ein wesentlicher Bestandteil der Überlebensstrategie dieses Pathogens ist. Für die Vernichtung von intrazellulären Mykobakterien durch die Makrophagen ist die NF-kB-Aktivierung erforderlich (Gutierrez et al., 2008). Wichtiger ist jedoch, dass die Blockade der NF-kB-Aktivierung die Fusion zwischen mykobakteriellen Phagosomen und Lysosomen verlangsamt. Über Mikroarray-Analyse des gesamten Genoms konnten wir einige interessante Kandidaten ermitteln. Die aussichtsreichsten Kandidaten sind dabei Rab34, Rab20 und Sortilin. Obwohl die Funktion dieser Proteine bei der Phagosomreifung noch nicht bekannt ist, war die erste Aufgabe, die Proteinfunktion in Verbindung mit der Phagosomreifung zu charakterisieren. Auf dieser Basis können wir dann das intrazelluläre Verhalten dieser Proteine während einer mykobakteriellen Infektion von Makrophagen besser verstehen. Abb. 1. RAW 264.7-Macrophagen, die Rab20-GFP (grün) exprimieren und eine starke Infi zierung mit Mykobakterien (rot) aufweisen. Einige der Bakterien befi nden sich in großen Rab20- GFP positiven Vakuolen. Foto: HZI, Gang Pei Rab-GTPasen und Phagosomreifung Für das Protein Rab34 haben wir die polyklonalen Antikörper bestimmt und gezeigt, dass sich Rab34 größtenteils im Golgi-Apparat lokalisieren lässt. Lebendzellbeobachtung, Western-Blot- Analyse und elektronenmikroskopische Untersuchungen haben gezeigt, dass das Protein Rab34 mit den Phagosomen in Verbindung steht. Da dieses Rab-Protein wahrscheinlich an der Fusion zwischen Phagosomen und Lysosomen beteiligt ist, haben wir den Einfl uss der Rab34-Mutanten auf die Akquisition von lysosomalen Markern durch Phagosomen untersucht. Unsere Daten zeigen, dass die Expression von konstitutiv aktiven Mutanten die Fusion zwischen Phagosomen und Lysosomen verstärkt. Für den Test mit Rab20 haben wir Rab20 in pEGFP-C1 geklont und einen negativen Mutanten generiert, der nicht an GTP binden kann. Das Protein Rab20 steht mit dem Golgi- Apparat und großen Vesikelstrukturen in Verbindung, und vermutlich hat dieses Protein eine bestimmte Aufgabe bei der Makropinosom-Bildung. Zudem besteht ein Zusammenhang zwischen dem untersuchten Protein und den Latexkugelphagosomen in der Frühphase der Internalisierung. Bei der mykobakteriellen Infektion wurde das Protein Rab20-GFP in die mykobakteriellen Phagosomen eingebaut (Abb. 1), und wir untersuchen derzeit, ob dieses einen Einfl uss auf die Phagosomreifung hat. Zuordnung lysosomaler Enzyme zu Phagosomen Sortilin vermittelt den direkten Stofftransport lysosomaler Enzyme vom Golgi-Apparat zu den Latexkugelphagosomen – ein weiterer Transportweg für Proteine, um während der Phagosomreifung an den Lysosomen vorbei zu den Phagosomen transportiert zu werden (Wähe et al., 2010). Wir planen, den mykobakteriellen Stofftransport und die Vernichtung der Mykobakterien mit einem Sortilin-KO-Mausmodell zu untersuchen (in Zusammenarbeit mit Dr. A. Nykjaer, Aarhus, Dänemark). Desweiteren untersuchen wir, welche Aufgabe das Sortilin bei der mykobakteriellen Phagosomreifung hat. Wir werden verschiedene Mutanten des Sortilin einsetzen, die keine Signale an Adapterproteine, Endozytose oder Retromer-Interaktionen weitergeben. Fabrino, D. L., Bleck, C. K., Anes, E., Hasilik, A., Melo, R. C., Niederweis, M., Griffi ths, G., & Gutierrez, M. G. (2009) Porins facilitate nitric oxide-mediated killing of mycobacteria. Microbes and Infection 11, 868-875. Gutierrez, M. G. & Griffi ths, G. (2009) Phagosome-cytoskeleton interactions. In: Intracellular Niches of Pathogens A Pathogens Guide through the Host Cell, (Schaible, U.; Haas, A.) Wiley-VCH, Weinheim, Germany. Wähe, A., Kasmapour, B. , Schmaderer, C., Liebl, D., Sandhoff, K., Nykjaer, A., Griffi ths, G., & Gutierrez, M. G. (2010) Sortilin mediates the transport of Acid Sphingomyelinase and Prosaposin from the Golgi to phagosomes. Journal of Cell Science 123, 2502-11 (Cover).
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