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68 WISSENSCHAFTLICHER ERGEBNISBERICHT | Infektion und Immunität | Mikrobielle Pathogenese Analyse bakterieller Virulenz mittels Proteomics Der Modellorganismus L. monocytogenes wird in diesem Forschungsthema genutzt, um die zeitliche und räumliche Dynamik von Wirt-Pathogen-Interaktionen auf Proteinebene aufzuklären. Speziell wird das Effektor-vermittelte Wirtszellsignalling mittels qualitativer Phosphokinomanalye studiert. Weil das Voranschreiten vom ersten Erwerb von P. aeruginosa bis zur nachhaltigen Kolonisierung der Lunge von Patienten mit Zystischer Fibrose (CF) direkt mit der Überlebensrate korreliert, wird in Kooperation mit der Ambulanz der Medizinischen Hochschule Hannover ein hochsensitiver Immunoproteom Workfl ow zur Identifi zierung diagnos- tischer und prognostischer antigener Marker etabliert. Des Weiteren untersucht das Projekt Signaltransduktionsprozesse, die für das bakterielle Pathogen P. aeruginosa und Epithelzellen von CF-Patienten spezifi sch sind. Strukturelle Analyse von Proteinen, die an Wirt-Pathogen-Interaktionen beteiligt sind Die Aufklärung von Wirt-Pathogen-Interaktionen unter atomarer Aufl ösung liefert mechanistische Einsichten, die der Entwicklung neuer Ansätze zum Eingriff in den Infektionsprozess dienen. Die 3D-Strukturen mikrobieller Virulenzfaktoren und – wenn bekannt – ihrer Komplexe mit Wirtszellinteraktionspartnern und Rezeptoren werden mit Hilfe der etablierten Techniken der Röntgenkristallo- graphie und der NMR-Spektroskopie mit hoher Aufl ösung bestimmt. Der Hauptschwerpunkt liegt auf Virulenzfaktoren, die zu mikrobieller Adhärenz und Invasion und zum Umbau des Wirtszellzytoskeletts beitragen, sowie auf Komponenten und Effektoren von Type-III-Sekretionssystemen, Schlüssel-Genregulatoren mikrobieller Virulenz sowie Prionproteinen. Die oben genannten Forschungsfelder werden von einem multidisziplinären Team auf Projektebene bearbeitet. Die beteiligten Wissenschaftler gehören zu verschiedenen Abteilungen und Forschungsgruppen des HZI und bringen eine breitgefächerte Expertise mit. Die Highlights der auf Projektebene gewonnenen Ergebnisse sind in den folgenden Projektberichten beschrieben. Genomkarte eines hochinfektiösen klinischen Mycobacterium tuberculosis-Isolates aus Lateinamerika. Gene verschiedener funktioneller Kategorien sind in verschiedenen Farben dargestellt. (siehe Bericht Seite 80)
WISSENSCHAFTLICHER ERGEBNISBERICHT | Infektion und Immunität | Mikrobielle Pathogenese 69 01.1 Strukturelle Analyse von Virulenzfaktoren PROJEKTLEITER | Prof. Dr. Dirk Heinz | Abteilung für Molekulare Strukturbiologie | dih@helmholtz-hzi.de PROJEKTMITARBEITER | Davide Ferraris | Thomas Heidler | Dr. Christian Kambach | Dr. Björn Klink | Dr. Jörn Krauße | Dr. Anja Menzel | Nick Quade | Dr. Stefan Schmelz | Ulrich Wiesand Pathogene Bakterien nutzen ein Arsenal an Virulenzfaktoren, um natürliche Barrieren des Wirtes zu überwinden, Abwehrmechanismen zu blockieren oder zu umgehen und um Wirtsprozesse zu ihrem eigenen Vorteil umzuprogrammieren. Da diese Faktoren meist in der Wirtszelle fehlen, sind sie potenzielle Zielmoleküle für neue Antibiotika. Das Ziel dieses Projektes ist es, durch Röntgenstrukturanalyse mikrobieller Virulenzfaktoren im Komplex mit ihren Wirtsrezeptoren ein möglichst präzises Bild der Pathogen-Wirt-Interaktionen während des Infektionsprozesses zu gewinnen. Listeria InlB aktiviert die humane Rezeptor-Tyrosin- Kinase Met durch Dimerisierung L. monocytogenes ist ein gefährlicher Lebensmittelkeim, der in Neugeborenen, älteren Menschen und immungeschwächten Individuen Listeriose auslösen kann – eine systemische Krankheit mit hoher Sterblichkeitsrate. Die Fähigkeit des Bakteriums, Wirtszellbarrieren zu überwinden, hängt essenziell von zwei Invasinen ab, die an der Oberfl äche des Bakteriums lokalisiert sind: den Internalinen A und B (InlB). InlB wechselwirkt dabei mit der Rezeptor-Tyrosin-Kinase Met, dem natürlichen Rezeptor des Hepatozyten-Wachstumsfaktors (HGF). Aus der Struktur des InlB/Met Komplexes, die wir im Jahre 2007 aufklären konnten, ging der Mechanismus der Met- Aktivierung noch nicht zweifelsfrei hervor. In einer zweiten Kristallform des Komplexes konnten wir ein Met/InlB/InlB/ Met-Dimer identifi zieren, das mit einer Rezeptor-Aktivierung kompatibel ist. Das InlB-Dimer-Arrangement konnte auch in verschiedenen InlB-Kristallformen gefunden werden. Durch Disulfi d-Crosslinking von InlB (Abb. 1) konnten wir kürzlich die Rolle dieser InlB-Dimerisierung für die Met-Aktivierung bestätigen. Das kovalent verbrückte InlB-Dimer zeigte sogar eine stärkere Met-Aktivierung als HGF. Im Gegensatz dazu führte die Schwächung der InlB-Wechselwirkungsoberfl äche durch Einführung gegenüberliegender, positiver Ladungen zu einer vollständigen Inaktivierung des Rezeptors. Abb. 1. Struktur vom InlB Dimer (blau), das durch zwei Disulfi dbrücken kovalent verbunden ist (gelbe Verbindung in einem Feld hoher Elektronendichte (graues Netz)). Eine neue Klasse bakterieller Guanin-Austausch- Faktoren für humane GTPasen Die Dynamik des Aktin- Zytoskeletts ist essenziell für Zellteilung, Motilität oder interzelluläre Kommunikation. Sie ist strikt über zahlreiche Signaltransduktionswege reguliert, an denen Hunderte verschiedener Aktin-bindender Proteine beteiligt sind. Die meisten Signaltransduktionswege konvergieren auf kleinen GTPasen der Rho-Familie, die als molekulare Schalter verschiedene Aktin-Filament-Strukturen induzieren. Rho GTPasen sind wichtige Ziele von Pathogenen, welche die Signaltransduktionswege über Virulenzfaktoren beeinfl ussen, die wiederum die Wirkung Rho-interagierender Proteine simulieren. Shigella fl exneri IpgB1 und IpgB2 sowie Map aus pathogenen E. coli sind prototypische Mitglieder einer faszinierenden neuen Familie bakterieller Effektoren, die ursprünglich als GTPase-Nachahmer klassifi ziert wurden. Sie induzieren Filopodien (Map) oder Lamellipodien und Stressfasern, was für IpgB1 und IpgB2 jeweils Rac1 bzw. RhoA-Aktivität anzeigt. Wir haben die Kristallstrukturen von IpgB2 und seines Komplexes mit humanem RhoA gelöst (Abb. 2). Sie belegen, dass IpgB2 ein Aktivator (Guaninnukleotidaustauschfaktor, GEF) und kein Nachahmer von RhoA ist. Strukturen des Komplexes in verschiedenen Nukleotid-gebundenen Zuständen enthüllten den molekularen Mechanismus der GDP-Dissoziation, der Grundvoraussetzung für die nachfolgende GTP-Bindung an RhoA. Abb. 2. Struktur des Komplexes zwischen IpgB2 (blau) und RhoA (braun). GDP ist orange gefärbt und das GDP-koordinierende Mg 2+ -Ion als gelbe Kugel dargestellt. Die Switch (Schalter)-I- Region von RhoA ist als gelber Loop (Schleife) und die Switch-II-Region als grüner Loop dargestellt. Der „katalytische Loop“ von IpgB2 ist rot. Ferraris, D. M., Gherardi, E., Di, Y., Heinz, D. W. & Niemann, H. N. (2010). Ligand-mediated dimerization of the Met receptor tyrosine kinase by the bacterial invasion protein InlB. Journal of Molecular Biology 395, 522-532. Klink, B. U., Barden, S., Heidler, T. V., Borchers, C., Ladwein, M., Stradal, T. E., Rottner, K. & Heinz, D. W. (2010). Structure of Shigella IpgB2 in complex with human RhoA: Implications for the mechanism of bacterial GEF-mimicry. Journal of Biological Chemistry 285, 17197-17208.
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