(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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펩티드 - 10 ㎍/ml로 12 × 75 mm 튜브에서 세포를 배양하였다. 세포를 37℃에서 추가로 60분간 배양하여, 플
루오레세인 표지 대장균을 섭취하게 한 후에, 세포를 1% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 그 다음에, 샘플을
플로사이토메트리로 분석하여, 휘도 함수로서 식작용의 양을 측정하였다 (식작용 활성이 높으면 높을수록, 대식
세포 집단의 형광성이 높아진다). 양성 염색된 세포의 % 양성 평균 형광 강도 (MFI)로서 데이터를 나타낸다.
식작용 검정 결과: 본 발명의 펩티드 및 펩티드 배합물은 뮤린 대식세포의 식작용 활성에 대해 저해 효과를 나
타내지 않았다.
실시예 12:
아폽토시스 유도 검정
인간 A549 세포 (인간 폐포암 기저 상피 세포)를 아넥신-5 아폽토시스 검정 실험에 사용하였다. 아넥신-5는 칼
슘 의존적으로 산성 인지질에 결합하는 고도로 보존된 단백질 패밀리의 멤버이다. 아넥신-5는 포스파티딜세린
에 대하여 고친화성을 갖는다. 포스파티딜세린은 세포가 아폽토시스 또는 세포 괴사에 의한 사멸을 겪는 경우
에 원형질막의 내측에서 외층으로 전위되며, 이는 사멸될 세포가 식세포에 의해 인지되는 시그널로서 작용한다.
아폽토시스 사인 (sign)을 분석하기 전에, 테스트 펩티드 - 10 ㎍/ml를 A549 세포에 24 시간 노출시켰다.
아폽토시스 유도 검정 결과: 본 발명의 펩티드 및 펩티드 배합물은 인간 폐 세포상에서 아폽토시스를 유의적으
로 유도하지 않은 것으로 나타났다.
실시예 13:
아폽토시스 예방 검정
인간 A549 세포 (인간 폐포암 기저 상피 세포)를 아넥신-5 아폽토시스 검정 실험에 사용하였다. 아넥신-5는 칼
슘 의존적으로 산성 인지질에 결합하는 고도로 보존된 단백질 패밀리의 멤버이다. 아넥신-5는 포스파티딜세린
에 대하여 고친화성을 갖는다. 포스파티딜세린은 세포가 아폽토시스 또는 세포 괴사에 의한 사멸을 겪는 경우
에 원형질막의 내측에서 외층으로 전위되며, 이는 사멸될 세포가 식세포에 의해 인지되는 시그널로서 작용한다.
A549 세포를 테스트 펩티드 - 10 ㎍/ml로 30분간 전처리한 다음에, C2 세라마이드에 노출시켰다. 세라마이드는
미토겐 활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 및 스트레스 활성화 키나아제 (JNK/SAPK)의 활성화를 통해 세포 아폽토
시스를 매개한다. C2 세라마이드는 세라마이드의 막 가용성 합성 유사체이다.
아폽토시스 예방 검정 결과: 본 발명의 펩티드 및 펩티드 배합물은 인간 폐 세포상의 세라마이드-유도 아폽토
시스에 대해 유의적인 보호를 나타내지 않았다.
실시예 14:
Th1/Th2 사이토카인 프로파일링 검정
Balb/c 마우스 (1923년에 유래된 일반적인 균주로, 다수의 상이한 리서치 분야에 사용됨. 또한 20회 이상의 상
이한 연속 형매 교배 (brother-sister mating) 생산에 의한 동종 교배로서 분류됨, Balb/c 마우스는 알비노로
사이즈가 작음)를 PBS (5 ㎍/인젝션) 중의 오발부민 (오발부민은 통상 테스트 동물의 면역 반응을 자극시키는데
사용되는, 난백에서 발견되는 주요 단백질임)으로 1, 15, 및 29일째에 면역화시켰다. 50일째에, 마우스의 비장
을 채취하였다 (오발부민으로 최후 부스트 (boost) 3주 후에). 세포를 배양하여 (2 × 10 5
/웰, 삼중 실험), 배
지 또는 테스트 펩티드 - 10 ㎍/ml로 30분간 배양하였다. 그 후에, 추가의 오발부민을 세포의 시험관 내에서의
재자극을 위해 10 ㎍/ml으로 세포에 가하였다. 72 시간 후에, 세포 상청액을 채취하여, 벡톤 디킨슨 (Becton
Dickinson) 마우스 Th1/Th2 사이토카인 CBA 키트를 이용하여 검정하였다. 이 키트는 단일 샘플 중의 인터루킨-
2 (IL-2), 인터루킨-4 (IL-4), 인터루킨-5 (IL-5), 인터페론-γ (IFN-γ), 및 종양괴사인자-α (TNF-α) 단백
질 레벨을 측정하는데 사용될 수 있다. 키트 성능은 조직 배양 상청액 및 혈청 샘플 중의 특이적 사이토카인
단백질의 생리적으로 상응하는 농도 (pg/ml 레벨)의 분석에 최적화되어 있다.
공개특허 10-2010-0058551
Th1/Th2 사이토카인 검정 결과: 펩티드 1은 뮤린의 비장 세포에서 IL-2 생성을 82.1% 유도하였고, IFN-γ 생성
을 43.3% 감소시켰으며, IL-5의 생성을 34.5% 감소시켰고, TNF-알파 및 IL-4 생성을 유의적으로 변화시키지 않
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